喂饲前体提高悬浮培养水母雪莲细胞的黄酮产量

为提高水母雪莲细胞悬浮培养的生物量及次级代谢产物黄酮的含量,在培养基中喂饲肉桂酸、乙酸钠和苯丙氨酸等三种黄酮生物合成前体,考察了它们对水母雪莲细胞TUIP-8悬浮培养的影响.在(17±1)℃环境中悬浮培养TUIP-8水母雪莲细胞,喂饲这三种前体均能显著促进雪莲黄酮的生物合成,并且对细胞的生长抑制效应较小.在接种时喂饲前体,低浓度添加肉桂酸(7.14 mg/L)、乙酸钠(3.57 mg/L)和苯丙氨酸(3.57 mg/L)更有利于提高黄酮产量.培养后期喂饲前体的效果要好于接种时喂饲,其中17.85 mg/L的乙酸钠对黄酮合成的促进作用最强,可使黄酮含量从7.8%提高至12.4%,黄酮产量可提高63%.在(25±1)℃环境中悬浮培养TUIP-8水母雪莲细胞,喂饲前体促进雪莲黄酮生物合成的效果不明显,与对照相比黄酮产量只提高5%～10%.反应器培养的雪莲细胞总黄酮含量可下降至8.5%,但在培养后期使用含有28 mg/L乙酸钠、60 mg/L苯丙氨酸的改进MS培养基,雪莲细胞的黄酮含量可恢复至11%,细胞密度可达到21 g(干重)/L.在悬浮培养水母雪莲细胞过程中添加乙酸钠和苯丙氨酸等前体物质可以促进雪莲黄酮的合成.     

用弱化dhfr双顺反子载体在CHO细胞中高效表达低分子量尿激酶突变体

将二氢叶酸还原酶基因(dhfr)克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒(ECMV)内部核糖体进入位点(IRES)的下游,构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲蝶呤(MTX)加压提高表达水平的双顺反子真核表达载体pIRES-dhfr.利用该表达载体表达了一种无糖基化和具有凝血酶抗性的低分子量尿激酶型纤溶酶原激活剂(LMW-uPA)突变体(缺失尿激酶原的1-143位氨基酸,Arg156→Lys,Asn302→Ala),用脂质体转染方法将表达载体pIRES-dhfr/LMW-UK转染CHO-dhfr-细胞后经过一轮MTX筛选,几乎所有获得的单克隆细胞株都表达LMW-UK,其中约50%为表达水平较接近(500-5000 IU/106cells/d)的高表达阳性克隆.用转瓶无血清培养表达水平约为17.5pg/cell/d的rCHO细胞系LB2-UK,收集的上清经过阳离子交换柱和凝胶过滤层析两步纯化后,获得的重组蛋白的纯度可以达到99%.用S-2444发色底物法检测,所获得的突变体双链UK比例大于98%.