转基因与强化褪黑素动物生产

随着现代生物学的不断发展并结合原核胚微注射和体细胞核移植技术,转基因已成为当今动物生物技术研究的热点。国内转基因生物育种重大专项的开展加速了转基因动物与转基因食品的研究进程。如何更好地利用转基因技术解决人类对畜产品的需求问题,是摆在科研人员面前的重大课题。褪黑素是一种主要由动物松果体分泌的吲哚类激素,具有调节睡眠、抗衰老、神经保护、促进细胞生长、调控生殖内分泌等生物学功能。本文对转基因技术的发展与应用、转基因动物、转基因食品生产及安全评价、褪黑素的研究现状进行简要综述,并尝试从转基因角度探讨褪黑素的研究与应用,预测其发展前景。     

基于CRISPR系统基因编辑与基因调控技术的发展

由规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)以及CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)组成的系统被发现广泛存在于细菌及古菌中,是机体长期进化形成的由RNA指导的降解外源遗传物质的适应性免疫系统。由于该系统可以识别靶向序列完成DNA的双链切割,因此从2013年起,CRISPR/Cas9系统即被改造为基因编辑工具。作为一种新型的基因组编辑技术,CRISPR/Cas9系统具有设计简单、特异性强、效率高等优点,为基因组定向改造调控和应用带来了突破性的革命,并且迅速在基础理论、转基因动物生产、基因诊断和临床治疗等领域中得到广泛的研究与应用。然而,CRISPR/Cas9也存在着脱靶效应和外源基因插入困难等一些亟待解决的问题,这在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的应用。因此,近年来围绕CRISPR系统改进获得了一系列可用于基因编辑与基因表达修饰的新工具。本文介绍了CRISPR系统的组成、工作原理,并综述了近几年来基于CRISPR系统开发的几种新型基因编辑工具以及基因表达修饰工具的研究进展和应用,并对其应用前景和发展方向进行了展望。     

外源褪黑素处理方式对荷斯坦奶牛体内褪黑素富集与代谢的影响

为研究正常情况下经产荷斯坦奶牛24 h内血液中褪黑素浓度的变化情况,探索不同外源褪黑素处理方式对荷斯坦奶牛血液褪黑素浓度的影响,本研究采用颈静脉注射、颈部皮下注射、颈部皮下埋植和口腔灌服外源褪黑素等方式处理经产荷斯坦奶牛,观察血液中褪黑素浓度的变化情况并分析褪黑素在体内的分泌规律及代谢速率。结果显示,在24 h内,经产荷斯坦奶牛血液中褪黑素浓度变化明显,04：00浓度最高,为8.30 ng/mL,16：00浓度最低,为2.08 ng/mL。皮下埋植和口腔灌服外源褪黑素以后,血液中褪黑素浓度升高幅度较小;皮下注射46.4、4.64和0.464 mg褪黑素后,血液中褪黑素浓度迅速升高,1 h后达到峰值,分别为561.94、487.03、92.89 ng/mL,极显著高于注射前（P<0.01）;静脉注射46.4、4.64和0.464 mg褪黑素后,血液中褪黑素浓度迅速升高,0.5 h之后达到峰值,分别为767.68、639.19、110.56 ng/mL,极显著高于注射前（P<0.01）,高水平褪黑素可稳定持续48 h。本研究证明了荷斯坦奶牛体内褪黑素分泌有明显的昼夜节律性,静脉或皮下注射外源褪黑素可以迅速提高血液中褪黑素的浓度,且血液中褪黑素的代谢速度与褪黑素的浓度高度相关,随着血液中褪黑素浓度的增加,褪黑素的代谢速度明显加快。     

二花脸公猪不同耐冻性精子的蛋白质组学分析

目的 二花脸猪是我国优良的地方猪种之一，冷冻精液可提高二花脸公猪的利用率，并加强其种质资源保护，但目前生产的二花脸猪冷冻精液基本不能满足生产需要。研究通过分析二花脸公猪不同耐冻性精子的蛋白质组学，以促进二花脸公猪精子耐冻性蛋白质标志物的筛选，从遗传水平分析精子耐冻性的影响因素，为提高精子耐冻性提供参考依据。方法 通过冻存14头二花脸种公猪的精液，再对冷冻精液的冻后质量进行分析，根据精子冻后活率和冻后活力的高低筛选出耐冻性好和差（good freezability ejaculates, GFE和poor freezability ejaculates, PFE）的公猪各3头，利用串联质谱标记(tandem mass tag, TMT)技术对GFE组和PFE组的精子蛋白进行定量蛋白质组学分析，鉴定出GFE组和PFE组精子中的差异蛋白(differentially abundant proteins, DAPs)。利用GO富集分析对差异蛋白的功能进行注释，利用 KEGG富集分析对差异蛋白的生物通路进行注释，通过STRING蛋白质互作数据库进行差异蛋白的互作网络分析并利用Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。结果 研究发现GFE组和PFE组间共存在138个差异蛋白，PFE组与GFE组相比,有109个DAPs上调，29个DAPs下调。GO富集分析表明，共124个DAPs富集到47个GO term，主要富集到“细胞进程”“单有机体过程”“分子结合”“细胞”“细胞组分”等GO term。KEGG富集分析表明，DAPs主要富集到“肾素-血管紧张素系统”“补体和凝血级联”“血小板活化”等通路。从PPI网络可见53个节点和69 条连接边线，有8个具有强互作关系的蛋白ALB、ACRBP、ACR、ZAN、ZPBP2、HSPA5、FGB、FGG，这些蛋白质的功能主要富集于“单受精”“有性生殖”“精细胞发育”等与动物生殖生理以及精子发生密切相关的功能。进一步分析表明，GFE组和PFE组间的DAPs主要包括氧化还原相关蛋白（GSTM3、PRDX5、ALB、PDIA1、PDIA4等）、精子发生与功能相关蛋白（HSPA5、MFGE8、DNAH1、DNAH7、CUL3等）、能量相关蛋白（HK1、PGM1等）以及凋亡与炎症相关蛋白（THBS1、ELSPBP1、CP等）；PPI网络图分析可知3个DAPs（MME、ANPEP和PRCP）在肾素-血管紧张素系统（RAS）中相互作用。结论 二花脸公猪不同耐冻性精子的蛋白质组分存在明显差异，可能对精子的冷冻性能产生影响，这些DAPs可作为精子耐冻性的候选蛋白标志物。     

褪黑素与卵泡刺激素对小鼠卵巢卵泡发育及其血管生成的影响

为了探讨褪黑素(Mel)与卵泡刺激素(FSH)对雌性动物卵巢卵泡发育及其血管的影响，选取40只3周龄ICR雌性小鼠随机均分为4组，即：对照组(Control组)、褪黑素组(Mel组)、卵泡刺激素组(FSH组)和卵泡刺激素+褪黑素组(FSH+Mel组),腹腔分别连续注射生理盐水、Mel、FSH和FSH+Mel后的第13天8:00采集血样及卵巢。每组采集5只小鼠的左侧卵巢进行固定，HE染色观察卵泡发育状况，免疫荧光技术观察卵泡血管状况；剩余卵巢利用Western blot测定Bax、Bcl-2的蛋白表达量。结果：与对照组相比，显著升高的有：Mel组和FSH组卵泡直径50～150μm卵泡数，FSH组和FSH+Mel组血清雌二醇、孕酮浓度，Mel组、FSH组和FSH+Mel组Bcl-2蛋白表达，Mel组>250～350μm卵泡CD34荧光强度，FSH组和FSH+Mel组>350～450μm卵泡毛细血管数和CD34荧光强度(P<0.05);显著降低的有：Mel组、FSH组和FSH+Mel组Bax蛋白和卵泡闭锁率(P<0.05);极显著升高的有：FSH组和FSH+Mel组卵...