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利用PCR方法获得副猪嗜血杆菌S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因全长DNA,将PCR纯化产物与pMD18-T载体连接并转化E.coil DH5α菌株,重组阳性质粒测序并采用生物信息学软件对所推导的氨基酸序列进行三维结构分析。结果表明,该基因全长510bp,并与GenBank中登录的其他5株菌株luxS基因完整参考序列进行比较,同源性均在70%以上。用ExPAsy软件包预测了推导蛋白的特性,运用Swiss-PDB viewer软件的SWISS-Model处理器,并利用同源建模的思想建立HPS-luxS的三维结构。拉马钱德兰图证明,构建的luxS蛋白的空间结构是合理的。 相似文献
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应用pGEX原核表达载体构建了牛朊蛋白的1个正常重组蛋白和3个单氨基酸变异体的原核表达质粒,即pGEX-BoPrP(93~241)、pGEX-BoPrP(93~241)(S154N)、pGEX-BoPrP(93~241)(A129V)和pGEX-BoPrP(93~241)(Q234R)。经转化E.coli BL21(DE3).均表达了预期大小约为42.4ku的融合蛋白。在优化的诱导表达条件下,各重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30%~45%的融合蛋白。经免疫印迹检查,所有融合蛋白均可与抗牛单克隆抗体4C11反应。表明,单氨基酸突变并不影响单抗4C11的识别表位。 相似文献
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叠朊(Dpl)是朊蛋白(PrP)的横向同源物,两者的功能密切相关。本研究旨在制备能够特异检测重组表达的或者动物组织中Dpl的抗血清,以用于研究Dpl的功能及其与PrP的关系。根据已克隆的汉族人、中国黄牛、甘肃土种羊的Dpl基因,将其Dpl成熟蛋白编码区分别定向克隆到表达载体pET-30a(4-)上,将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)pLys S,IPTG诱导表达。将表达并纯化的牛重组Dpl免疫4只青紫蓝兔,制备牛Dpl的抗血清,SDS—PAGE分析表明人、牛和羊的重组Dpl在E.coli中获得了高效表达。用Ni—NTA树脂亲和层析和胶洗脱法纯化了上述表达产物,ELISA和West—blot分析表明,制备的牛Dpl抗血清与重组人、牛和羊的Dpl以及牛和羊睾丸组织的Dpl发生了特异性反应,却不与重组人、牛和羊的PrP发生反应。上述结果表明制备的Dpl抗血清可以作为人、牛和羊Dpl的检测试剂和研究材料。 相似文献
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人朊蛋白基因的克隆与原核表达 总被引:3,自引:1,他引:3
以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein,PrP)基因Prnp户的开放阅读框(ORF),与pMD -18T载体连接后转入E.coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性为99.6%,推导的氨基酸序列同源性为99.8%,将编码人成熟PrP的基因定向克隆到 pET-30a(+)表达载体,将重组质粒pET-homPrP转化E.coli BL21(DE3),在37℃下用1.0 mmol/L IPTG诱导,重组融合蛋白获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的20%~25%.用Ni-NTA 树脂亲和层析纯化了表达产物.Western-blotting分析表明,融合蛋白被抗PrP的单克隆抗体特异识别.因此,在大肠杆菌中表达的人成熟PrP融合蛋白可以作为制备PrP抗体的免疫原. 相似文献