山羊胎期肺发育的形态学研究

对3～22周龄山羊胎儿肺进行了肉眼、光镜和透射电镜观察，结果表明：1．7～22周龄山羊胎儿肺的外部形态与胎龄无关，肺的外部形态以左二右四叶者为多见．肺的叶间裂和右肺副裂常不完整，以浆膜、肺组织或混合性组织(肺组织及浆膜)融合；2．山羊胎儿肺的发育分为5个时期：胚胎期(3～5周)肺芽分支形成主支气管，主支气管长度不断增长并萌芽出叶支气管，均衬以假复层柱状上皮。腺状期(6～12周)以支气管树发育为主，小支气管衬以假复层和／或单层柱状上皮；终蕾呈腺状，上皮细胞由假复层柱状逐渐变为单层柱状，胞核向细胞顶端移行；终蕾上皮细胞游离面可见短小的微绒毛；线粒体、粗面内质网及核糖体随着胎龄增加而逐渐增多，它们均位于细胞顶部。小管期(13～14周)以呼吸部发育为主，原始肺泡开始形成，呼吸性细支气管衬以未分化的立方上皮；终蕾腺状结构逐渐消失，终蕾上皮细胞由高矮不等的单层柱状上皮逐渐演变为立方形的原始肺泡上皮；细胞游离面可见较多的微绒毛，胞质内线粒体、粗面内质网及核糖体较发达。囊状期(第15周)呼吸部发育显著，肺内细支气管及其末端呈现出“充气”状态；部分原始肺泡上皮细胞分化为扁平的肺泡Ⅰ型细胞和立方形的肺泡Ⅱ型细胞；Ⅱ型细胞内出现嗜锇小体。肺泡期(16～22周)以肺泡的形成和分化为主，更多的肺泡上皮分化为扁平的肺泡Ⅰ型细胞和立方形的肺泡Ⅱ型细胞。此期，毛细血管内皮与部分肺泡上皮贴近，可将肺泡上皮细胞区分为3种：Ⅰ型细胞，呈矮柱状或椭圆形，胞质中有较明显的核糖体、扩张内质网及变性线粒体；形成了由Ⅰ型细胞一基膜一内皮细胞组成的气血屏障。Ⅱ型细胞，胞质内含丰富的嗜锇板层小体和核糖体，内质网扩张呈大小不一的泡状，多泡体出现，线粒体膨大变性，细胞游离面可见少数微绒毛。Ⅲ型细胞，为未分化细胞，呈立方形，胞体较小，胞核相对较大，呈圆或椭圆形，胞质少，呈带状．电子密度低，细胞器少。     

转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化

 【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞(表达LPL和PPARγ-D)、成骨细胞(表达Osteonectin和Osteocalcin)、肌细胞(表达myf-5、myf-6和myoD)、内皮细胞(表达CD31、CD34、CD144和eNOS)和软骨细胞(表达COL2A1)。【结论】从猪胎儿大脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因神经干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对神经干细胞进行标记、追踪,作为示踪标记进行神经干细胞体内移植研究。     

山羊BLG基因5′调控序列克隆及其调控GFP基因细胞的表达

通过PCR扩增出2.2kb的山羊β-乳球蛋白基因5′端的调控序列,包括第一外显子和第一内含子。测序结果表明,该序列与GenBank中登录序列相比,同源性为99.5%。用其替代表达载体pEGFP-c1上原来的启动子CMV,指导报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在山羊乳腺细胞中的瞬时表达,结果发现该调控序列可以有效指导报告基因的表达,从而初步验证了所克隆的山羊乳球蛋白(BLG)基因表达调控序列的有效性。表明克隆的调控序列可用于乳腺生物反应器的研究。     

猪瘟病毒E2基因乳腺特异表达载体的构建

为进一步研究基因疫苗的免疫机制与免疫效果,探讨外源基因在乳腺中的定位表达,应用重组PCR方法,将猪瘟病毒(CSFV)E2基因与牛β-乳球蛋白(BLG)5′部分调控序列连接起来,并插入到真核表达载体pEGFP-C1上,构建了含有CSFVE2基因的乳腺特异表达载体。     

奶牛β-酪蛋白基因5′和3′调控区的克隆及序列分析

利用普通及重组PCR技术克隆了奶牛β-酪蛋白基因(CSN2)5′调控成分(2826bp)和3′调控成分(620bp)。前者包括5′上游调控序列、第一外显子及部分第一内含子;后者主要包括最后一个不翻译的外显子和3′侧翼序列。纯化PCR产物通过pMD18-TVector亚克隆后测序并进行软件分析的结果表明,2个克隆片断与奶牛CSN2相应区域同源性分别为99.0%和98.0%,并且包含有全部的CSN2表达核心调控序列和多个转录、翻译因子的结合位点。     

山羊乳腺上皮细胞的生长特性

用组织块培养法获得山羊乳腺细胞原代培养物。根据山羊乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同将二者分离纯化，对细胞生长特性进行了光镜观察。结果如下：细胞可形成闭合型细胞群和开放型细胞群。乳腺上皮细胞与成纤维细胞混生时，细胞之间形成许多腔状结构。纯化的乳腺上皮细胞通过单细胞悬浮后传代，部分细胞形成岛屿状聚集，部分细胞以贴壁的自由单个细胞散在形式存在。上皮细胞增殖可形成圆顶型结构，呈乳头状，称之为乳球体；可产生乳腺上皮细胞并分泌乳汁。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型．大多数上皮细胞呈短梭形或多角形。细胞之间紧密相靠。互相衔接。连接成片，呈蜂窝状；细胞核呈圆形或椭圆形．核仁2～4枚；部分细胞呈圆饼状，体积较大；出现部分长形细胞；接触抑制的上皮细胞形态不均一。纯化的山羊乳腺上皮细胞传代至第15代时其生长仍正常，经透射电镜观察发现细胞表面微绒毛极为发达，细胞质中线粒体和粗面内质网丰富，细胞质内有大量脂滴及小泡，表明第15代山羊乳腺上皮细胞增殖活力旺盛。染色体数目分析表明．该细胞系稳定，在离体培养条件下细胞不发生转化。山羊乳腺上皮细胞系的细胞染色体数目为60．染色体组型为2n=60。     

CB处理和胞质去除对山羊孤雌胚体外发育的影响

为优化山羊核移植方案，实验研究了细胞松弛素B(cytochalasin-B，CB)处理和胞质去除对山羊孤雌胚体外发育的影响。将山羊MⅡ期卵母细胞用7.5 μg/mL CB分别处理5、10、15、20和30 min(实验Ⅰ)，处理后分别去除1/4～1/2的细胞质(实验Ⅱ)，并在每个实验中设对照组(不做任何处理)，孤雌激活后，用碘化丙啶和Hoechst 33258 对囊胚ICM细胞及TE细胞进行双染色，分别记录内细胞团(ICM)和滋养层(TE)细胞数。结果表明, 实验组Ⅰ及对照组均获得了较高的卵裂率(分别为76.83%～85.50%和86.50%)及较高的囊胚期发育率(分别为57.40%～62.20%和59.80%)，囊胚细胞数及ICM细胞数在各组间无统计学差异(P＞0.05)；实验Ⅱ，随着去除胞质比例的1增大孤雌胚的卵裂率(75.76%～16.07%)、囊胚率(38.67%～6.67%)、囊胚细胞总数(107.15～63.67)及ICM百分率(26.32%～19.37%)呈下降趋势，超过1/3时孤雌胚的发育力显著降低(P <0.05)。实验结果指出，(1)7.5 μg/mL CB在30 min以内对山羊孤雌胚体外发育力无不利影响；(2)胞质去除量控制在1/3以下对孤雌胚的发育影响不大。     

猪乳腺干细胞的分离培养及EGFP基因转化

利用乳腺干细胞培养技术体系,从成年猪乳腺组织中分离培养乳腺干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入乳腺干细胞,诱导转基因乳腺干细胞向乳腺上皮细胞分化,观察其分化特点。结果成功分离培养出乳腺干细胞,获得转EGFP基因乳腺干细胞,它们在表达EGFP的同时仍具有分化潜能,能分化成梭形和扁平状细胞。结果表明,从成年猪乳腺组织中分离乳腺干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因乳腺干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能,可以用EGFP基因对乳腺干细胞进行标记、追踪,为EGFP基因作为示踪标记对乳腺干细胞用于体内移植研究奠定了基础。     

羊乳腺上皮细胞的形态观察

用组织块培养法获得山羊乳腺细胞原代培养物,并根据山羊乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同将二者分离纯化。对细胞形态进行光镜观察发现:纯化的山羊乳腺上皮细胞传代至第15代时其生长仍正常。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大;部分细胞呈长形。纯化的乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状,称之为乳球体。     

出生前山羊颈段脊髓运动神经元的发育

应用HE染色和超薄切片技术研究第6周到出生前山羊脊髓腹角运动神经元胞体的发育变化。结果表明：1．出生前山羊脊髓腹角运动神经细胞发育包括未分化期、不成熟期、发育成熟期和成熟期4个阶段。2．发育过程中，山羊脊髓运动神经元细胞核的体积持续增长；常染色质增加，异染色质减少且趋边分布；核仁数量减少，中央核仁在第8周形成，以后逐渐发育成熟；核膜渐趋成熟。3．山羊脊髓运动神经元胞体内膜系统的发育变化的规律与神经元的发育阶段相适应。