猪流行性腹泻病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种适用于现场快速检测的猪流行性腹泻病毒(PEDV)LAMP技术,基于羟基萘酚蓝(HNB)的可视化显色特点,根据PEDV M基因编码区序列,设计合成1套引物,通过反应物浓度和反应条件优化,建立了可闭管检测的PEDV RT-LAMP检测方法。特异性和灵敏度试验结果显示,建立的RT-LAMP检测技术快速、灵敏、特异,可于1 h内检出0.2 mL 0.1 TCID₅₀/mL的病毒RNA,与实时荧光RT-PCR检测方法灵敏度一致,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪链球菌2型核酸不发生交叉反应。利用该方法对187份送检的粪拭子及病死猪组织样品进行应用检测,检出阳性样品9份,与荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。试验结果表明,所建立的方法快速、特异,重复性满足要求,适用于送检样品的PEDV快速检测。     

常见肉类成分荧光PCR检测试剂盒的比较

目前市场上肉类成分检测试剂盒种类繁多。为了评价不同厂家试剂盒的应用效果,选取当前市场上4个品牌的5种肉类成分荧光PCR检测试剂盒,对其特异性、灵敏性及效率成本进行了分析比较。结果显示：4个品牌的5种肉类成分荧光PCR检测试剂盒特异性均较好,不同肉类之间没有交叉反应;但检测同一种肉类的不同品牌试剂盒及同一品牌检测不同肉类的试剂盒灵敏性存在差异;不同品牌的试剂盒检测时间和成本也有区别,A品牌耗时最短,D品牌价格最高。结果表明,不同品牌试剂盒的灵敏性、检测耗时和检测成本各有特点,使用者可根据使用目的及经费预算选择合适的试剂盒。     

口岸截获猪肉肠的主要猪病病原核酸检测

为了解非法跨境携带猪肉肠传播动物疫病的风险,对北京口岸截获的猪肉肠进行8种猪病病原核酸的检测分析。结果显示:282份样品中,猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)以及猪细环病毒1型(TTSuV1)均有检出;除PRV阳性率较低外(3.9%),其余3种阳性率较高,均大于35%。这表明口岸非法携带猪肉肠存在传播多种动物疫病的风险,提示相关执法部门应强化口岸动物检疫,降低疫病传入风险。     

金鱼造血器官坏死病传入风险评估

为评估鲤科疱疹病毒-2型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）随水生动物及产品跨境传入风险,按照OIE传入风险评估框架,从危害识别、风险评估及风险管理3个方面,开展了CyHV-2跨境传入风险分析,并提出了相应的风险控制措施。分析认为：养殖用活易感鱼类的风险预测为高,而食用的、冰冻和冰鲜的以及用做饵料的易感鱼类风险预测为中,易感鱼类加工后的产品、非易感鱼类及运输活鱼的水、包装、工具等风险预测为低。建议对进口的活易感鱼类（金鱼、鲫鱼及其普通变种）,严格采取相应的风险管理措施;对食用的、冰冻和冰鲜的易感鱼类避免从疫区进口,用做饵料的易感鱼类改用经过加工处理后的野杂鱼;而加工后的鱼制品及非易感鱼类,可允许自由贸易;对运输活鱼的水、包装等进行强制常规消毒。     

纳米孔测序技术对一份禽流感病毒阳性样品的分子溯源

H5亚型禽流感为人兽共患病,可严重威胁人类和动物健康。直接对样品进行禽流感病毒靶向全基因组测序、系统进化分析,对于揭示禽流感病毒分子特征具有重要作用。本研究采用第三代靶向纳米孔测序技术,对1份禽流感病毒阳性拭子样品进行了全基因组测序。序列鉴定结果显示,病毒为H5N5亚型禽流感病毒,序列覆盖度达96.44%,仅PB1基因约480 bp的序列未被测出;HA蛋白裂解位点含有5个连续的碱性氨基酸,具备高致病性禽流感病毒分子特征,未发现向SAα2-6 Gal受体基因转变的氨基酸突变;HA基因进化分析结果显示,病毒为2.3.4谱系,NA基因为欧亚谱系。本研究采用靶向纳米孔测序技术,成功对灭活禽泄殖腔拭子中的禽流感病毒进行了基因组测序,证实该技术快速、便捷,可直接用于拭子样品的病毒全基因组测序,适用于动物流感病毒的快速分子鉴定与溯源。     

病死猪圆环病毒2型检测及全基因序列分析

为准确检测猪圆环病毒2型（PCV2）并分析其基因序列情况,在序列比对分析的基础上,设计一对简并引物和一条探针,经体系优化建立了PCV2的荧光PCR方法。该方法可检出10拷贝的PCV2质粒DNA,不与猪瘟病毒等多种病毒发生交叉反应。对送检的2批次45份病死猪脏器进行检测,检出25份阳性样品,与套式PCR方法的复合率为95.6%;对3份强阳性样品使用一对全基因组扩增引物,扩增了PCV2型全基因片段;经克隆测序后分析,发现3个病毒基因分别属于2种基因亚型（PCV2b和PCV2d）。本研究对于PCV2的准确检测及其变异特征的了解具有参考意义。     

马梨形虫病病原双重荧光PCR快速检测方法的建立与应用

在序列比对分析的基础上,设计2对引物和2条MGB探针,经体系优化建立了可快速鉴别检测两种马梨形虫病病原（马泰勒虫和驽巴贝斯虫）的双重荧光PCR检测方法。该方法可分别检出22和31基因拷贝的虫体DNA,且不与其他马病病原发生交叉反应。应用建立的荧光PCR检测方法,对采自进出口马匹的10份马全血和20份马血清进行检测,结果从马全血中检出2份马泰勒虫阳性样品。使用一对马泰勒虫EMA1全基因扩增引物,从2份阳性样品中扩增了EMA1基因。克隆测序后,对该基因全序列进行分析,证实其为马泰勒虫特异基因序列;2份样品的基因序列相似性为98.9%,存在6个氨基酸变异;2个样品中的EMA1基因不完全一致,表明2个感染样品中的虫体可能为不同的马泰勒虫虫株。     

国礼动物变化趋势及检疫监管

为了解国礼动物发展现状,给优化检疫管理政策提供支持,本文梳理了自1949年以来我国接收国礼动物和作为国礼走出国门的年代、动物物种及赠送和受赠国家等情况,阐述了动物作为国礼的原因、变化趋势,分析了其在政治、运输饲养、疫病传播等方面存在的风险,提出了通过部门协作、通关运输、隔离检疫、饲养与治疗、防疫消毒、信息沟通、应急处置等措施,来提升对国礼动物监管水平的建议。     

沙门氏菌LAMP可视化检测方法的建立

为实现沙门氏菌的快速现场检测,根据沙门氏菌invA基因编码区序列,设计合成1套引物,通过对反应物浓度和反应条件优化,建立了沙门氏菌属特异性LAMP检测方法;通过对invA基因8个区域的6条引物配对进行等温扩增,并在反应体系中加入HNB来指示反应结果,实现了反应的快速闭管检测。灵敏度试验显示,建立的方法可以检出稀释至3.6×10~1 CFU/mL菌液所提取的DNA;特异性试验显示,建立的方法与大肠杆菌DNA、志贺氏菌DNA、布鲁氏菌试管凝集抗原DNA、炭疽沉淀抗原DNA以及猪链球菌2型DNA不发生交叉反应,但能检出鸡白痢、禽伤寒沙门氏菌凝集抗原以及马流产试管凝集抗原提取的DNA;重复性试验显示,3个稀释度菌液DNA的3次重复检测均为阳性;应用试验显示,从经增菌培养的200份进境猴粪拭子样品中检出阳性2份,与细菌分离鉴定检测结果一致。结果表明,所建立的方法敏感性和特异性较高,重复性满足实际要求,可用于进境动物样品的沙门氏菌检测。