绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立检测绵羊家畜衣原体血清抗体的间接ELISA方法,本试验构建pET-28b-ompA重组表达质粒,经诱导表达和纯化后,对重组主要外膜蛋白(MOMP)进行Western blot鉴定;以MOMP为包被抗原,通过反应条件筛选建立绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、重复性和符合性,并进行临床样品检测。结果显示,MOMP以包涵体形式表达,经Western blot鉴定重组蛋白具有良好的反应原性。优化反应条件为：抗原包被浓度为1 mg/L,37℃静置孵育1 h;血清抗体稀释倍数为1∶100,37℃反应1 h;酶标二抗稀释倍数为1∶5 000,37℃孵育1 h;底物显色条件为37℃避光5 min。利用52份绵羊血清确定ELISA方法的阳性判定临界值为P/N=2.156。该方法的敏感性、特异性和重复性较高。用该方法与间接血凝试验对86份血清进行检测,两者符合率为73.2%。用该方法对临床采集的205份绵羊血清样品进行检测,阳性率为34.1%。结果表明,本试验建立的绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法具有较高的特异性和敏感性,可应用于临床检测。     

基于截短MOMP蛋白的绵羊流产衣原体抗体间接ELISA方法的建立

为了建立检测绵羊流产衣原体MOMP(main outer membrane protein)蛋白抗体的间接ELISA方法,试验将编码MOMP蛋白的基因序列经密码子优化后进行基因合成,并克隆和原核表达截短蛋白,以该蛋白为抗原建立绵羊流产衣原体抗体的间接ELISA方法,优化该方法的反应条件,同时验证其特异性、敏感性和重复性,最后用该方法对临床待检羊血清进行检测,并与间接血凝试验试剂盒的检测结果进行比较。结果表明：截短蛋白MOMP_201～390的表达、纯化效果最好。经探索,优化后的间接ELISA方法最优反应条件：抗原包被浓度为1 mg/L,37℃包被2 h,待检血清最佳稀释度为1∶100,血清和酶标二抗的最佳作用时间分别为45 min、60 min。建立的间接ELISA方法的敏感性较高,特异性和重复性较好,使用该方法从209份临床待检羊血清样本中检出47份阳性血清,与间接血凝试验试剂盒分别检测临床待检羊血清样本86份,总符合率为80.23%。说明基于截短蛋白MOMP_201～390建立的绵羊流产衣原体抗体间接ELISA方法可用于绵羊流产衣原体临床血清...     

响应面法优化含活性肽CC34毕赤酵母重组菌冻干营养保护剂的研究

【目的】利用响应面分析法优化含活性肽CC34毕赤酵母重组菌的冻干营养保护剂组合配方。【方法】通过单因素试验,筛选脱脂乳粉、海藻糖、山梨醇和谷氨酸钠提高毕赤酵母重组菌存活率的最佳范围;利用Box-Behnken法建立毕赤酵母重组菌存活率回归方程,分析3种保护剂组合对菌体存活率的效应关系。【结果】脱脂乳粉浓度为10%时毕赤酵母重组菌冻干存活率最高,达到51.23%;海藻糖浓度为15%时冻干存活率最高,达到67.50%;山梨醇浓度为20%时冻干存活率最高,达到52.19%;谷氨酸钠浓度为3%时冻干存活率最高,达到36.92%。通过响应面法获得含活性肽CC34毕赤酵母重组菌冻干保护剂组合中脱脂乳粉、海藻糖、山梨醇的浓度分别为10.75%、15.70%、20.19%,通过最优模型预测毕赤酵母重组菌的存活率为77.00%,应用此最优保护剂组合进行冻干试验,菌体冻干存活率为78.98%。【结论】本试验通过响应面法优化了毕赤酵母重组菌复合冻干保护剂配方,在脱脂乳粉浓度为10.75%、海藻糖浓度为15.70%、山梨醇浓度为20.19%条件下,可获得较高的菌体冻干存活率(78.98%)。该复合冻干保护剂可用于含活性肽CC34毕赤酵母重组菌的保存和后续试验研究。