大肠杆菌glgC基因的定点突变及高效表达

通过PCR方法,从E.coliJM109基因组DNA中扩增到全长为1296bp的glgC基因,对其进行定点突变,获得第296位和336位氨基酸同时突变的glgC336基因。将2者亚克隆进pET-30a,成功构建了重组表达载体pET-C和pET-C336,转化大肠杆菌BL21(DE3),在1mmol/LIPTG诱导下进行表达。SDS-PAGE电泳分析显示,在约53kD处有1条明显的蛋白表达带,证明目的基因已得到高效表达,且重组蛋白表达量占菌体蛋白总量的77.3%。     

兰州百合同源四倍体诱导及其基因组大小估算

兰州百合(2n=2x=24)是重要的“药食同源”植物,进行其种质创新和基因组大小分析对于丰富其种质资源和生物学信息具有重要意义。以兰州百合的种子和试管小鳞茎为试验材料,通过秋水仙素浸泡诱导染色体加倍,经流式细胞仪倍性检测获得的同源四倍体植株分别有10和4株,四倍体诱导率分别为21.11%和33.27%。为了估算兰州百合基因组大小,以小麦品种“中国春”为内标,通过流式细胞仪测算兰州百合二倍体和四倍体植株中的DNA含量,得出兰州百合基因组为64.9 Gbp,是“中国春”核基因组的4倍。     

导入Chi—linker—Glu和Bar基因获得抗真菌和抗除草剂的转基因烟草

构建重组表达载体pBIb—CG（含有Chi-linker—Glu融合基因和Bar基因）,利用农杆菌介导法将其携带的Chi—linker—Gm融合基因和B4r基因转化烟草（Nicotiana tobaccumL）品种红花大金子。经根癌农杆菌侵染和共培养后,用100mg／LKan＋500mg／LCef筛选抗性芽．获得30株抗性植株,抗性植株再生率为37％：分别对抗性再生植株中Chi一砌ker—Glu融合基因和Bdr基因的特异性引物进行PCR检测,结果27株为阳性,占90％。PCR、Souchem杂交结果证明,外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验和除草剂抗性试验表明,转基因烟草植株对木霉菌fTricko derma viride）、镰刀菌（Fusarium solanif sppisii）和除草剂都表现出一定的抗性。     

玉米逆境响应基因ZmGST23克隆和表达分析

谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是植物抗氧化系统的重要成员,在初生代谢、次生代谢、细胞信号转导及逆境响应等生物学过程中发挥着重要作用.本研究以GenBank中公布的玉米谷胱甘肽-S-转移酶23基因(ZmGST23)mRNA序列(GenBank登录号:NM_001111524)为依据,采用RT-PCR方法从玉米(Zea mays)自交系F83中克隆得到ZmGST23基因669 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码222个氨基酸,蛋白分子量为24.84kD,理论等电点为5.68.保守结构域分析表明,该基因具有GSTs所特有的N端及C端结构域,并含有典型的G位点及H位点,属于Tau类谷胱甘肽硫转移酶.系统进化分析表明,ZmGST23编码蛋白与高粱(Sorghum bieolor)GST蛋白亲缘关系最近,且在不同物种间存在明显的种属特性.启动子序列分析结果显示,ZmGST23基因启动子区含有多个响应逆境及植物激素的作用元件,包括脱落酸(abscisic acid,ABA)响应元件、生长素(auxin,IAA)响应元件、赤霉素(gibberellin,GA)响应元件、厌氧响应元件、防御及逆境响应元件以及干旱诱导的MYB转录因子(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)结合位点.胁迫诱导表达分析表明,ZmGST23的表达显著受干旱脱水、水涝、盐、ABA、IAA、GA、低温及高温等非生物胁迫的诱导.组织特异性表达分析表明,ZmGST23基因在幼芽和成熟叶片中表达量较高,在幼根、花丝、苞叶、雌穗及雄穗中表达量较低,存在明显的组织特异性.将ZmGST23基因片段连接至原核表达载体pEASY-E1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,用0.5 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ3-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达1～4 h后获得30 kD的诱导蛋白.本研究结果为进一步利用该基因进行玉米抗性改良提供了一定的理论依据.     

反义AcInv基因转化马铃薯方法的研究

马铃薯反义AcInv基因,采用农杆菌介导法,选用生产上推广的9个普通四倍体栽培种,对影响转化的各个因素进行了优化研究。结果表明:在愈伤组织诱导过程中,卡那霉素(Km)的适宜浓度为100 mg/L;生根过程中为50 mg/L。外植体的预培养为:茎段2 d,叶盘3 d效果较好;农杆菌浓度当OD600值为0.5时对茎段和叶盘的转化效果均较佳;茎段和叶盘侵染时间分别达8 min和10 min时转化率较高;外植体与农杆菌共培养时间分别为2 d和3 d时,茎段和叶盘的转化率较高;各个品种的外植体在卡那霉素抗性培养基上均能形成愈伤组织,但只有1号(“大西洋”)最后从愈伤组织上分化成苗,形成正常植株,植株再生率为11.2 %,PCR扩增检测表明大部分转基因植株为阳性。     

8%茶黄素防治水稻稻瘟病田间药效试验

采用大区对比法,对拿敌稳和茶黄素的3个不同剂量的处理与清水进行稻瘟病防效对比试验,结果表明,各药剂处理对稻瘟病均有一定的防治作用,能够提高水稻结实率,增加产量,其中以处理2(公顷用茶黄素1500mL)的产量最高。     

交趾黄檀采穗圃幼化技术

交趾黄檀采穗圃经过多代采集穗条扦插繁殖苗木,采穗母株年龄不断增大,会造成成熟效应,必须保持交趾黄檀采穗母株幼龄状态,克服它由幼龄期向成熟期转化。当采穗圃种植采穗后,每间隔约5年要新种植母株更新采穗圃为宜。可以利用交趾黄檀根系繁殖苗或根系萌芽形成新植株进行更新种植,达到保幼最佳效果。     

马铃薯损伤诱导型启动子Wun1基因的克隆及其GFP表达活性

通过聚合酶链式反应(PCR),以马铃薯基因组DNA为模板,根据已报道Wun1序列设计了一对特异引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了Wun1基因片段,通过序列分析与文献报道的碱基序列有96.86%的同源性,该基因已登录到GenBank(No.AY803296)。以pBIPG(携带GFP基因)的质粒DNA为模板,通过PCR技术亚克隆到了源自水母(Aequorea)大小为756bp的绿色荧光蛋白(GFP)基因,与已知序列同源率为100%。利用GFP基因作为报告基因,构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性的pBIG(35S-GFP)和pBIWG(Wun1-GFP)两个植物表达载体,采用基因枪法进行对洋葱表皮细胞的遗传转化,检测Wun1启动子在受体细胞中调控基因表达的活性,结果表明克隆到的Wun1启动子活性强于组成型表达的35S启动子,GFP瞬时表达的分析方法也让我们有效的筛选到用于进行马铃薯抗病育种的调控元件。     

维管特异表达启动子BSP的克隆与活性检测

为了研究维管特异表达启动子BSP的活性和组织特异性,从杨树基因组中克隆得到维管特异表达启动子BSP,利用该启动子与绿色荧光蛋白（GFP）报告基因构建植物表达载体,采用基因枪法转化烟草叶片,并在高渗培养基上培养过夜,后转移到诱导培养基上(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+Kan 100 mg/L)培养生根并长到一定高度后,剪下已形成维管组织的叶脉和根,制成切片,然后在OLYPUS BX51/BX52型荧光显微镜下用蓝光激发,观察各个组织细胞中的绿色荧光,同时以未转化的烟草材料做为对照。结果表明：BSP启动子所驱动的GFP基因在烟草的维管组织细胞中得到了高水平的表达,而在烟草的其他组织及对照的任何组织中几乎不表达。通过GFP在烟草维管组织中的瞬时表达,表明了该启动子具有维管组织特异性表达活性特点。     

西北地区耕地土壤真菌DNA提取方法比较

由于西北土壤理化性质的复杂性和真菌特殊性,所以从土壤中提取真菌基因组DNA就相对细菌更困难。在2种常用的土壤微生物基因组DNA提取方法与在传统提取方法的基础上,结合了一种专门适用于真菌的提取方法进行了比较,并且利用真菌28SrDNA通用引物U1/U2进行扩增。三种提取方法比较结果表明:SDS法提取的DNA纯度最低,传统CTAB-SDS的DNA产量最低,实验室的提取方法既可以提高DNA产量又可以保证DNA的片段完整性,并且本实验室的提取方法扩增效果最好,可广泛应用于西北地区土壤真菌的分子生物学研究。