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为了将合成的核酸探针点样到玻片 上制备成基因芯片,先用常规PCR扩增动物 组织中钩端螺旋体特异片段,再用Cy3标记 引物,通过不对称PCR获取荧光素标记的靶 序列,然后与制备的芯片杂交,扫描仪记录结 果。同时,以PCR技术为对照,进一步观察 基因芯片技术检测动物传染源中钩端螺旋体 的特异性、敏感性及可行性。常规PCR扩增 问号钩端螺旋体阳性标本,出现单一482bp 的扩增产物,而双曲钩端螺旋体及其他螺旋 体、病原、正常动物组织均无任何DNA扩增 条带,芯片杂交结果与常规PCR方法结果一 致。用芯片和PCR对动物组织中不同浓度 钩端螺旋体的检测,最低检测浓度分别为10 条和100条钩端螺旋体,芯片检测的敏感性 高于常规PCR法。用基因芯片与PCR分别 对标本进行检测,5只人工感染的豚鼠肾、 肝、心、血等组织的检测结果均为阳性;28份 疫区野鼠肾标本阳性结果分别为8份和4 份,10份可疑病猪肾标本阳性结果分别7份 和5份;5份非疫区野鼠肾、5份正常猪肾标 本以及其他微生物的检测结果均为阴性。结 果表明,基因芯片技术可快速、灵敏、特异地 检测动物传染源中问号钩端螺旋体。 相似文献
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金免疫层析法检测囊虫循环抗原试验研究 总被引:2,自引:0,他引:2
应用胶体金和免疫层析技术进行了检测金免疫层析法(GICA)囊虫循环抗原(CA)试验研究。5株抗囊虫McAb和一株多抗用于最佳配对的筛选,一株用于标记胶体金,另一株包被NC膜。以双抗体夹心ELISA为对照,GICA用于CA检测,观察其敏感性、特异性和稳定性。结果显示,以McAb 1A5和1B6配对的结果最佳,1A5最适标记量为10μg/mL,186最佳包被浓度为1 g/L;用GICA和ELISA两种方法检测囊虫CA,痈猪血清和囊液的符合率达100%,病人血清和脑脊液的符合率达80%;CA最低检测量为10 ng,检测正常猪、人及其他疾病血清,均呈阴性;检测时间5-15 min,整个实验仅一步操作;GICA试纸条分别在4℃和室温下保存105 d以及在37℃保存45 d,检测结果均未发现改变。以上结果表明,快速检测囊虫循环抗原的金免疫层析法具有简便、快速、敏感、特异和稳定的特点,适合基层使用。 相似文献
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猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建与筛选 总被引:1,自引:0,他引:1
在体外将猪带绦虫虫卵孵化为有活力的六钩蚴。采用商品化试剂盒抽提六钩蚴总 RNA、m RNA,反转录为双链c DNA,再加 Eco R Adapter。在去除小片段后 ,dsc DNA与 λgt11噬菌体 DNA连接 ,经蛋白包装 ,构建了猪带绦虫六钩蚴λgt11c DNA文库。该文库效价为 3.5× 10 9pfu/ m L ,重组 DNA片段大小为 0 .5~ 3.2 kb,平均为 1.6 kb,蓝白斑比 1∶ 9。用抗体探针对文库进行免疫学筛选 ,在消除非特异性反应的基础上筛选约 10 6 重组子 ,共得到 118株强阳性克隆 ;应用 PCR鉴定上述部分阳性克隆 ,均扩增到 0 .5 kb以上的片段。结果显示 ,构建的文库合格 ,含六钩蚴所有抗原基因 ,可用于六钩蚴 c DNA克隆的筛选 ;用免疫学与 PCR联合筛选 c DNA文库 ,可消除假阳性 相似文献
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猪囊虫病基因工程疫苗的生产工艺研究 总被引:1,自引:0,他引:1
从重组抗原的表达、复性与纯化、疫苗的配制及疫苗的质量控制等4个方面对猪囊虫病基因工程疫苗的生产工艺进行了探索。确定重组抗原表达的最佳培养液为LB磷酸盐培养液,诱导剂为10g/L乳糖,并根据接种量,溶解氧、罐压、发酵时间等对发酵结果的影响,确定了发酵培养的最佳条件。在重组抗原的复性与纯化方面,工程菌的裂解条件为选用溶菌酶感作用再超声波破菌,超声强度为240W5次,包涵体的纯化先采用低浓度的尿素洗涤2 相似文献
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应用免疫酶染色法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
用免疫酶染色法检测Vero细胞培养物,陈旧石蜡切片和人工感染试验鸡组织中的AVAV,并比较了AVAV强毒和弱毒株在组织中情况,结果发现,试验鸡于感染AVAV弱毒株后1-5天、感染AVAV强毒株后1-9天出现病毒血症;跗关节、跖趾关节、趾关节,趾屈肌健、脾脏、肝脏等组织中病毒的检出最高,存在时间也最长;在感染后3-20天于感染鸡法氏囊、感染后3-11天于感染鸡胸腺中检出了强毒株,在这两组织中未检出A 相似文献
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用免疫酶染色法检测Vero细胞培养物、陈旧石蜡切片和人工感染试验鸡组织中的AVAV,并比较了AVAV强毒和弱毒株在组织中的分布情况。结果发现,试验鸡于感染AVAV弱毒株后1~5天、感染AVAV强毒株后1~9天出现病毒血症;跗关节、跖趾关节、趾关节、趾屈肌健、脾脏、肝脏等组织中病毒的检出率最高,存在时间也最长;在感染后3~20天于感染鸡法氏囊、感染后3~11天于感染鸡胸腺中检出了强毒株,在这两组织中未检出AVAV弱毒株。感染8小时后的Vero细胞培养物和陈旧石蜡切片均被检出AVAV。 相似文献
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鸡病毒性关节炎病毒的提纯结构蛋白及其免疫活性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
采用差速离心和蔗糖递度超速离心法提纯了鸡病毒性关节为病毒(AVAV)9307株,并用SDS-PAG电泳技术分析其结构蛋白,该病毒主要由8条多肽组成(VP1~VP8),它们的分子量分别是145,130,115,72,70,65,42,39KD。用Westernblotting免疫印迹技术分析这些多肽的免疫活性,与同源病毒株抗血清出现5条可见的反应带,分别是VP1,VP2,VP4,VP5和VP7;与异 相似文献
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猪囊虫病基因工程疫苗的研制及应用 总被引:6,自引:1,他引:6
从猪带绦虫六钩蚴cDNA文库中筛选目的基因并进行克隆表达,重组抗原用血清学方法和猪体免疫试验进行鉴定,筛选保护性抗原基因。将具有免疫保护作用的重组抗原纯化,并与免疫刺激复合物佐剂结合,制成猪囊虫病基因工程疫苗。对工程菌的培养发酵、重组抗原的下游纯化及疫苗的配制、疫苗的中间试制进行了研究,确定了一套比较完善的生产工艺。应用昆明小鼠建立了猪囊虫病的实验动物模型,应用该模型进行上述疫苗的免疫预防试验,免疫1次和2次的免疫保护率分别为96.9%和98.4%。本动物的免疫预防试验显示,疫苗安全性好,免疫保护率达92.2%,且免疫组发现的囊虫多数已死亡。在流行区进行了田间和区域试验。免疫猪未有不良反应,囊虫感染率分别由20%降为1.1%和5.4%降为0.21%。用该疫苗对人工感染的囊虫病猪进行免疫治疗,发现在感染早期的治疗效果较好。免疫动物的体液免疫和细胞免疫的检测结果显示,该疫苗刺激机体产生抗体的时间早、持续时间长、效价高;可显著提高淋巴细胞转化率及E-RFC和Ea-RFC细胞、ANAE^ 细胞和粗粒型ANAE^ 细胞、抑制/杀伤性T细胞亚群的数量。以上结果表明,用大肠杆菌表达的重组抗原制备的猪囊虫病基因工程疫苗安全、高效,且成本低廉,可规模化生产,有成为预防猪囊虫病的一种新型生物制剂。 相似文献