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C端序列的删除对非出血重组蛇毒纤溶酶的影响 总被引:1,自引:1,他引:0
[目的]研究C端序列对非出血重组纤溶酶(rFⅡ)特异性、活性和热敏感性的影响.[方法]通过SOEing PCR方法构建删除C端序列的突变体,突变体和rFⅡ分别在P.pastoris中诱导表达.表达和纯化的蛋白用SDS-PAGE和Westeren blot进行鉴定.之后分析其生化特性.[结果]rFⅡ及突变体通过SDS-PAGE和Westeren blot得到证实.生化分析揭示:①突变体对显色底物N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys-pNA的催化效率(Kcat/Km)是rFⅡ的1.9倍;②突变体和rFⅡ对氧化的胰岛素B链拥有共同的优先裂解位点,可是在随后的裂解中开始展现差异;③突变体显示了更高的纤(原)活性;④热处理表明突变体相较r FⅡ对温度的增加更敏感;⑤通过圆二色谱测量,突变体的螺旋比例有所增加.[结论]删除的序列参与rFⅡ的特异性、活性和热敏感性,该序列可作为下一步优化的候选序列. 相似文献
2.
大鼠局灶性脑缺血模型及其与C反应蛋白变化的关系 总被引:34,自引:1,他引:33
目的 改进大鼠大脑中动脉梗塞法,建立更接近于临床缺血性脑卒中及其再扩灌注的可靠模型,并观察其与血甭C反应蛋白变化的。方法沿大鼠右颈内动脉插入长2.1 ̄2.3cm直径0.205mm的单股尼龙丝,直达大脑中动脉起始部开口,阻断其血流,观察大鼠神经病学改变及脑组织形态学变化,并测定血清C反应蛋白含量。结果 术后大鼠表现特殊体态及典型追尾征,6h大脑中动脉供血区出现缺血性外观(TTC染色)及相应组织学变化 相似文献
3.
目的:监测溶瘤病毒M1在组织中的传播情况,以更好地控制给药剂量,确保安全性。方法:建立一种基于TaqMan的实时定量PCR检测法,用于对组织中溶瘤病毒M1的检测和定量,并检测静脉注射病毒后多种实验动物体内的病毒载量和分布。结果:我们以一对特异的引物(Q3)和标准RNA开始SYBR Green RT-qPCR研究。通过优化实验方法发现当退火温度高于62℃时可降低基质效应,但却影响了扩增效率。因此我们建立了一步法TaqMan RT-qPCR实验,重新设计了一对Q3短引物(Q3S)。运用一步TaqMan RT-qPCR检测法和Q3S引物,在混有SD大鼠或食蟹猴基质RNA的背景下,均能特异性检测到低拷贝数的标准RNA。经验证,该方法适用于检测M1病毒在小鼠、SD大鼠和食蟹猴体内的组织分布。结论:利用Q3S引物构建的TaqMan一步法RT-qPCR能够定量检测不同动物不同组织样品中的M1病毒,具有特异性和敏感性,可进一步应用于临床样品的检测。 相似文献
4.
目的:克隆75AEST全长cDNA序列。方法:抽提在25mmol/LKCl条件下培养7d的大鼠小脑颗粒神经元的总RNA后,用DNA连接酶介导的5'RACE法克隆75A表达序列标签(EST)cDNA5'端未知序列,其产物亚克隆到pGEM-Teasy后进行序列测定以及同源性分性。结果:首轮5'RACE扩增出2.5kb序列后,75AEST鉴定为神经来源孤儿受体1(Nor1)基因的部分序列;再经过二次轮5'RACE,我们首次克隆Nor-1的全长cDNA序列。结论:T4DNA连接酶介导的5'RACE是一种效率较高的克隆mRNA5'端未知序列的好方法,为进一步研究Nor1在小脑颗粒神经元存活或分化过程中的作用奠定基础。 相似文献
5.
重组蛇毒纤溶因子rFⅡ偶联到聚氨酯表面及其纤溶活性评价 总被引:1,自引:1,他引:1
目的:通过聚氨酯表面偶联重组蛇毒纤溶因子rF Ⅱ来提高其纤溶活性。方法:在聚氨酯(PU)表面上涂覆含羧基硬段的聚氨酯溶液(PU1)制备羧基化表面聚氨酯(CPU),并用次甲基蓝吸附法测定表面羧基含量;在CPU表面上用EDC接枝双端氨基聚乙二醇(PEG),并用滴定法测定该表面的PEG接枝量;在CPU-PEG表面用EDC偶联重组蛇毒纤溶因子(rF Ⅱ),并用放射性同位素法测定该表面的rF Ⅱ偶联量,最后用试管定量法评价样品的纤溶活性。结果:CPU表面羧基含量为6.9μmol/cm^2,CPU-PEG2k和CPU-PEG4k表面PEG含量分别为0.162和0.180μmol/cm^2,CPU-PEG2k-^125Ⅰ-rFⅡ和CPU-PEG4k^125Ⅰ-rFⅡ表面rF Ⅱ含量分别为13.6和38.9ng/cm^2,与对照样品相比都有很大的提高。纤溶活性评价表明,所有偶联rF Ⅱ样品的纤溶活性都有提高,抗血栓性能得到有效改善。结论:具有PEG间隔臂偶联rF Ⅱ的样品其纤溶活性比没有PEG间隔臂的样品更优,采用PEG4k间隔臂偶联rF Ⅱ样品的纤溶活性为最高。 相似文献
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目的 :研究特异性p3 8分裂原激活的蛋白激酶 (MAPK)抑制剂SB2 0 3 580对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的作用及机制。方法 :体外神经元培养、凝胶电泳和SAPK/JNK分析盒测定JNK(c Jun氨基末端激酶 )活性。结果 :低钾 (KCl 5mmol/L)培养基诱导小脑颗粒神经元的具有典型形态学和生化特征的凋亡。但是 ,特异性的p3 8MAPK抑制剂SB2 0 3 580通过抑制凋亡 ,而促进低钾环境中培养的小脑颗粒神经元的存活。此保护作用具有浓度依赖性。培养于低钾环境中的神经元 ,其c Jun的表达和磷酸化水平升高 ,且激活了JNK的活性。当小脑颗粒神经元生长在含SB2 0 3 580 2 5μmol/L的低钾培养基中 ,c Jun的表达、磷酸化水平和JNK的活性都明显的降低。结论 :SB2 0 3 580可能通过抑制JNK的活性 ,降低c Jun的磷酸化水平而对低钾培养的小脑颗粒神经元具有保护作用。 相似文献
7.
观察磷酸化 C- JUN与谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡的关系。在培养的小脑颗粒神经元建立谷氨酸凋亡模型 ;采用 MTT法分析细胞存活率 ,相差显微镜观察形态学 ,DNA凝胶电泳法分析细胞凋亡和原位细胞荧光免疫组织化学法检测磷酸化 C- JUN。结果显示 ,谷氨酸诱导大鼠小脑颗粒神经元细胞体积缩小 ,突触断裂、消失 ,DNA电泳呈典型的“梯状”条带 ;谷氨酸处理 2 4 h后细胞存活率为 2 8.6%± 5.2 %。神经元在谷氨酸处理 5,30 min及 1 ,2 ,4,8,1 6和 2 4 h后均未检测到有磷酸化 C- JUN阳性细胞 ,与去极化组 ( 2 5mmol/L KCl)相同。而复极化组 ( 5mmol/L KCl)则在 30 min检测到大量的磷酸化 C- JUN阳性细胞 ,4h荧光最强并持续。处理 4h后 ,40 0倍荧光显微镜下 ,复极化组、去极化组和谷氨酸组的磷酸化 C- JUN阳性细胞数分别为 1 2 4± 1 7,8± 3,5± 3。上述结果提示 ,谷氨酸诱导小脑颗粒神经元凋亡 ,磷酸化 C- JUN不参与谷氨酸诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡。 相似文献
8.
观察磷酸化C-JUN与谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡的关系.在培养的小脑颗粒神经元建立谷氨酸凋亡模型;采用MTT法分析细胞存活率,相差显微镜观察形态学,DNA凝胶电泳法分析细胞凋亡和原位细胞荧光免疫组织化学法检测磷酸化C-JUN.结果显示,谷氨酸诱导大鼠小脑颗粒神经元细胞体积缩小,突触断裂、消失,DNA电泳呈典型的"梯状"条带;谷氨酸处理24 h后细胞存活率为28.6 %±5.2 %.神经元在谷氨酸处理5,30 min及1,2,4,8,16和24 h后均未检测到有磷酸化C-JUN阳性细胞,与去极化组(25 mmol/L KCl)相同.而复极化组(5 mmol/L KCl)则在30 min检测到大量的磷酸化C-JUN阳性细胞,4 h荧光最强并持续.处理4 h后,400 倍荧光显微镜下,复极化组、去极化组和谷氨酸组的磷酸化C-JUN阳性细胞数分别为124 ±17,8±3,5±3.上述结果提示,谷氨酸诱导小脑颗粒神经元凋亡,磷酸化C-JUN不参与谷氨酸诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡. 相似文献
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咖啡因对谷氨酸诱导神经元凋亡的保护作用 总被引:4,自引:2,他引:4
目的 研究咖啡因对谷氨酸诱导的神经元凋亡是否具有保护作用,并对其机制进行探讨。方法 采用DNA凝胶电泳分析及Hoechst33258核染色方法进行凋亡分析;使用荧光指示试剂Fura 2检测单细胞内游离钙浓度变化。结果 谷氨酸可诱导小脑颗粒神经元凋亡,咖啡因能拮抗谷氨酸的这一效应,其IC50为5-0mmol·L-1。咖啡因的这一保护作用不能被forskolin模拟,也不能被Rp cAMP阻断。此外,内质网Ryanodine受体阻断剂dantrolene也不能取消咖啡因的保护作用,咖啡因不影响谷氨酸诱导的钙超载。结论 咖啡因对谷氨酸诱导的神经元凋亡具有保护作用,这一保护作用与咖啡因升高细胞内cAMP和Ca2+水平的药理作用无关。 相似文献