mGM-CSF重组质粒的构建、表达及活性鉴定

目的 构建pc—mGM—CSF重组质粒载体，为mGM—CSF基因治疗肿瘤的研究奠定基础。方法 采用RT—PCR方法从小鼠脾脏中获得目的基因mGM—CSF，克隆于pcDNA3.1／Myc-His(-)(A)质粒上，成为pc-mGM-CSF，用PCR、酶切进行鉴定，然后用脂质体转染小鼠骨髓瘤细胞SP2／0，用G418筛选后通过RT—PCR和SDS—PAGE鉴定，将转染SP2／0上清加入NFS-60细胞，检测蛋白活性。结果 重组质粒中含有mGM—CSF基因，在SP2／0中有表达，且表达产物能分泌到肿瘤细胞外，分泌到细胞外的产物用mGM—CSF依赖株NFS-60细胞检测证明具有生物学活性。结论 成功构建含mGM—CSF真核表达重组质粒，有助于进一步研究其抗肿瘤作用。     

GM-CSF基因免疫治疗小鼠骨髓瘤的实验研究

目的:探讨mGM-CSF基因免疫小鼠是否可以诱发小鼠对肿瘤的免疫应答。方法:用SP2/0肿瘤细胞皮下接种Balb/c小鼠建立肿瘤动物模型,再以皮下或肌肉注射空质粒或重组质粒4次,共400μg。8周后观察小鼠的抑瘤率、肿瘤质量、肿瘤组织淋巴细胞的浸润情况,检测血清中IFN-γ和IL-2浓度,MTT法体外检测CTL、NK细胞活性。结果:基因免疫Balb/c小鼠8周后,重组质粒皮下注射组肿瘤质量[(0.880±0.405)g]轻于对照组[(1.548±0.221)g,P<0.01];重组质粒肌肉注射组肿瘤质量[(0.378±0.411)g]明显轻于对照组[(1.554±0.249)g,P<0.001];重组质粒肌肉注射组肿瘤组织可见淋巴细胞浸润;IFN-γ和IL-2的浓度及CTL、NK细胞活性显著高于对照组。结论:GM-CSF基因免疫能诱发小鼠抗肿瘤作用,肌肉注射比皮下注射效果好。     

伏格列波糖中有机溶剂残留量的毛细管GC测定

建立了毛细管GC法测定伏格列波糖中11种有机溶剂的残留量。以50％DMF水溶液为溶剂，采用DB-624弹性石英毛细管柱，程序升温，FID检测器，载气为氮气。     

B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗安全性及抗肿瘤效应研究

目的:评估B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗用于C57BL/6小鼠的安全性及其诱导的抗肿瘤免疫效应。方法:应用免疫荧光、FCM检测瘤苗细胞ESAT-6-GPI的表达情况;以Western blot方法检测瘤苗细胞IL-21的表达情况;动物实验检测瘤苗体内应用的安全性;制备荷瘤鼠术后免疫模型,评价瘤苗免疫效果。结果:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞表面有靶抗原ESAT-6-GPI表达,并分泌IL-21。于C57BL/6小鼠皮下接种2×105个B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞,60天内未见致瘤,但能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应。结论:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗致瘤性明显下降,低剂量应用具有安全性,能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应。     

多发性骨髓瘤RPMI-8226和NCI-H929细胞表达ABCG2和ABCB5及意义

研究ATP结合盒(ABC)转运体ABCG2、ABCB5在多发性骨髓瘤(MM)RPMI-8226和NCI-H929细胞的表达及意义。方法:用实时定量反转录酶-聚合酶链锁反应(qRT-PCR)及蛋白印迹(Western blot)法检测MM细胞中ABCG2、AB-CB5的表达,并观察两株细胞在增殖、克隆、耐药及致瘤性等方面的差异。结果:qRT-PCR和Western blot显示AB-CG2、ABCB5均表达于RPMI-8226和NCI-H929细胞,且前者的表达水平较后者明显增高(P<0.05)。与NCI-H929细胞相比,增殖、克隆、耐药实验,RPMI-8226细胞增殖速度快、克隆形成能力强、对长春新碱的耐受性高(P<0.05)。成瘤实验显示第10周时RPMI-8226组鼠出现了肿瘤而NCI-H929组鼠始终未出现肿瘤。ABCG2、ABCB5高表达于RPMI-8226细胞,可能是其耐药性较NCI-H929细胞增高的机制之一。这将为MM细胞化疗药物的筛选和靶向耐药分子ABCG2、AB-CB5治疗MM提供实验依据。     

结核杆菌Ag85A和mGM-CSF共同表达载体的构建与CTL活性的诱导

构建、鉴定结核杆菌Ag85A和细胞因子GM CSF共同表达质粒 ,为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。先从质粒pBSby5中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pIRES上成为pI85A ,用PCR方法从pc mGM CSF质粒中扩增出mGM CSF ,构建于pI85A质粒上 ,成为共同表达质粒pI85AGM。然后转染 772 1细胞 ,进行蛋白的表达和鉴定。结果经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确。通过RT PCR、SDS PAGE、Westernblot检测证实Ag85A与mGM CSF基因的转录和蛋白表达正确。Ag85A与mGM CSF免疫组小鼠的CTL活性明显增强。表明细胞因子GM CSF和结核杆菌Ag85A共同表达载体构建成功 ,并能诱导小鼠的CTL活性 ,为研制新型结核病疫苗奠定了基础     

瘤体内直接注射mIL-21基因抑制小鼠实验性淋巴瘤生长及其机制的初步研究

IL 2 1的生物学功能比较广泛 ,能促进骨髓中的NK细胞增殖与分化并表达CD16分子 ,与抗CD4 0单克隆抗体(McAb)协同可刺激B细胞增殖 ,与抗CD3McAb协同可刺激T细胞增殖。我们利用先前构建的含小鼠IL 2 1基因重组质粒pcDNA3.1 mIL 2 1,直接在小鼠皮下Sp2 0肿瘤模型的瘤体局部注射治疗 ,探讨IL 2 1能否在肿瘤的基因治疗中发挥一定的作用 ,从而寻找新的用于肿瘤治疗的生物应答调节剂。取 6～ 8周龄BALB c雌鼠 ,以对数生长期Sp2 0细胞 5× 10 5背部皮下注射形成肿瘤模型。挑选肿块直径 0 .5cm左右小鼠 ,随机分pcDNA3.1 mIL 2 1质粒…     

ABCG2单抗联合NPs-PTX体外抑制MMCSCs作用初探

目的:研究ABCG2单抗联合Fe3O4纳米紫杉醇(NPs-PTX)对人多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)癌干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)体外抑制作用。方法:经免疫磁珠分选方法,从人MM细胞系NCI-H929和RPMI8226细胞中分选出CD138-CD34-细胞,采用CCK-8检测、流式细胞仪分析法观察ABCG2单抗联合NPs-PTX对MM CSCs增殖、迁徙的抑制作用和其对凋亡及细胞周期的影响。结果:ABCG2单抗联合NPs-PTX能有效的抑制MM CSCs增殖,抑制率达80%,与单用NPs-PTX比较(55%),差异有显著性(P0.05);ABCG2单抗联合NPs-PTX组迁徙率为0.6%,较NPs-PTX组(1.7%),差异有极显著性意义(P0.01);ABCG2单抗联合NPs-PTX能有效诱导MM CSCs凋亡,凋亡率达43.15%,与单用NPs-PTX比较(18.35%),差异有显著性(P0.05),并使MM CSCs发生G/M期阻滞。结论:ABCG2单抗联合NPs-PTX具有体外抑制人MM CSCs作用,其机制可能与其通过诱导细胞凋亡,发生细胞周期阻滞有关。     

基于甲基乙烯基醚／马来酸酐共聚物水凝胶三维培养卵巢癌细胞的研究

目的：验证卵巢癌SKOV-3细胞在自制甲基乙烯基杉马来酸酐共聚物水凝胶中培养形成的3D模型。方法：通过SKOV-3细胞生长曲线、迁移和侵袭能力、耐药实验等,对比自制的水凝胶培养基与市售BME胶和胶原蛋白胶I胶培养基对SKOV-3细胞若干特性的影响。结果：SKOV-3细胞在自制水凝胶TZ028和TZ029培养基第10—15天时,为3D细胞培养最佳时期;在Transwell实验中表现出与胶原蛋白I胶相似的细胞侵袭力,并优于BME培养基;在紫杉醇耐药实验中形成细胞3D结构耐药性要高于2D细胞培养（P〈0．05）;与BME和胶原蛋白I胶培养基相比,该细胞对相同浓度下紫杉醇耐药性差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：自制的甲基乙烯基彬马来酸共聚物和交联剂聚乙二醇交联反应形成的3D培养基质水凝胶,与商品化BME胶和胶原蛋白胶I胶培养基相比,具有类似的细胞培养功能。