软骨细胞的老化对软骨蛋白聚糖代谢的影响

目的:探讨体外培养猪耳软骨细胞在老化过程中,软骨蛋白聚糖(aggrecan)的代谢状况与分子结构的变化及其水解酶(aggrecanase)表达水平的改变。由此进一步阐明aggrecan在组织工程软骨构建中起决定性的作用。方法:取体外培养P1-P8各代猪耳软骨细胞及其培养液,爱茜蓝(Alcian Blue)法检测培养液中蛋白聚糖的含量和糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)的分子结构。RT-PCR检测aggre-canase-1和-2的mRNA表达水平。结果:在P1细胞的培养液中,蛋白聚糖的含量和长链/高度硫酸化的GAG含量都是最高的。由P4细胞开始,这2项指标均显著减少(P<0.01),且两者的变化趋势有显著的相关性(P<0.01)。Aggrecanase-1 mRNA在前3代细胞基本无表达,P4细胞中有显著上升(P<0.01),随后逐渐减少,P8细胞又不再表达。Aggrecanase-2 mRNA的表达呈随机状态,与细胞代数无显著性相关(P>0.05)。结论:体外培养软骨细胞的老化对aggrecan的代谢有非常大的影响。一方面aggrecan的合成减少、大分子聚合物形成受阻;另一方面胞外基质的水解作用加剧,最终导致老化细胞的基质崩解。     

共培养诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化的初步研究

目的 探讨软骨共培养体系诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化的可行性.方法 GFP标记的小鼠ES细胞初步分化为EB后,将EB消化为单个细胞,同猪关节软骨细胞按一定比例(1∶3)昆合后接种于PGA材料,体外培养1周后植入裸鼠皮下3周取材.对照组为EB细胞接种组及软骨细胞接种组.取材后行连续冰冻切片,切片分别做荧光拍照,HE染色及甲苯胺蓝染色.结果 组织学结果显示,EB细胞接种组形成畸胎瘤;软骨细胞对照组形成软骨组织;实验组形成软骨组织和畸胎瘤的混合体.甲苯胺蓝染色结果和荧光照片对照结果显示,部分软骨组织GFP阳性,由小鼠ES细胞分化而来.结论 软骨共培养体系可以诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化,但得到的软骨组织不纯,混有畸胎瘤组织.     

Aggrecan Northern探针的构建及其在组织工程研究中的应用

目的构建猪aggrecan探针,用于对组织工程化软骨及软骨细胞中aggrecan mRNA表达水平的Northern检测.方法取猪软骨细胞,RT-PCR扩增aggrecan球间区域(IGD)片段.将纯化的RT-PCR产物克隆入pUCm-T载体,酶切、测序鉴定.32P标记aggrecan探针,Northern杂交法检测组织工程化软骨和软骨细胞中aggrecan mRNA的表达状况.结果构建产物经鉴定,证实其包含了猪aggrecan IGD的基因序列.Northern结果显示,该探针可用于对组织和细胞中aggrecan mRNA表达水平的检测.结论在组织工程化软骨的研究中,利用Northern杂交法对样品中aggrecan mRNA的水平进行检测,具有良好的灵敏度、可信度和特异性.     

化学剂法对兔卵母细胞孤雌激活的效果

目的 研究钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)及3种酶对兔卵母细胞的激活率,并观察其体外发育情况.方法 兔超排后获得卵母细胞,经脱颗粒处理后用A23187和6-DMAP处理不同时间,体外培养5～7 d,观察细胞发育与囊胚形成情况.结果 钙离子载体A23187激活处理5 min后, 继续在2.0 mmol/L 6-DMAP中分别处理3.5、4.0、4.5、5.0 h,均能激活兔卵母细胞;以处理4.0 h的卵裂率最高(58.82%,20/34),并有15%(3/20)的囊胚发育率.透明质酸酶、胶原酶和胰酶处理20 min后, 均能激活兔卵母细胞,其中透明质酸酶处理20 min的激活率和卵裂率最高,分别为58.33%(28/48)和63.64%(28/44).结论 兔卵母细胞孤雌激活率与激活方法密切相关.化学激活剂的处理时间及消化酶的不同均对兔卵母细胞的激活产生显著影响.     

人和猪软骨细胞aggrecan球间区域基因的克隆和同源性分析

目的 分析人和猪软骨细胞aggrecan球间区域(interglobular domain,IGD)蛋白酶水解位点的同源性，在分子水平探讨猪软骨细胞作为组织工程化软骨研究模型的意义。方法 通过RT-PCR扩增人和猪软骨细胞aggrecan IGD片段，将纯化的RT-PCR产物克隆人T-载体，通过测序、软件分析及Northern杂交，比较二基因和氨基酸序列的同源性。结果 人和猪aggrecan IGD cDNA有84％的同源性。经PSI-BLAST(Position Specific Iterated BLAST)分析，相关的氨基酸序列的同源性也达到84％，表明其在进化过程中高度保守。Northem杂交可见，人和猪的aggrecan IGD探针对猪总RNA均有明显的分子量大小相同的放射自显影条带。结论 猪软骨细胞可以作为组织工程化软骨研究的模型，对软骨细胞老化和体内构建软骨的降解等过程中蛋白酶参与的aggrecan水解反应进行深入的探讨，为完善组织工程化软骨的构建提供分子水平的依据。     

人胚胎干细胞定向分化为血管内皮细胞的初步研究

目的诱导人胚胎干细胞定向分化为血管内皮细胞。方法将来源于人囊胚内细胞团的ES细胞,以含维甲酸的培养液经悬浮培养,先形成拟胚体,再将EB贴壁,换含TGF-β1的培养液继续培养,进行相差显微镜、免疫荧光、电镜等检测。结果人胚胎干细胞经诱导后分化成为血管样结构,Ⅷ因子免疫荧光检测呈阳性,Dil-Ac-LDL摄取实验呈红色荧光,透射电镜显示其与正常的人毛细血管非常相似。结论该方法可诱导人胚胎干细胞分化为内皮细胞,为骨创伤修复提供新的思路和手段。     

VSV-G蛋白修饰的GFP逆转录病毒的构建及表达

目的通过与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)共转染,使含绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒经超速离心得以浓缩,进一步提高GFP逆转录病毒的细胞感染效率。方法应用GFP-RV质粒转染PT67细胞,并用G418筛选出GFP阳性克隆,利用其产生的病毒上清液再转染GP2-293细胞,在G418筛选的同时,瞬时转染VSV-G基因。收集该GP2-293细胞产生的重组假病毒液,并通过低温超速离心制备含GFP基因假病毒的浓缩液,测定浓缩前后含GFP基因假病毒液滴度,并分别感染NIH 3T3细胞、软骨细胞、成纤维细胞、骨髓基质干细胞等,荧光显微镜下观察GFP在上述细胞内的表达情况,流式细胞仪检测GFP基因的转染阳性表达率。结果GFP-GP2-293细胞转染VSV-G基因后产生的重组假病毒液滴度为7.36×104CFU/mL,浓缩40倍后其滴度可提高至1.82×106CFU/mL。用浓缩前后含GFP基因假病毒液分别转染NIH 3T3细胞,GFP阳性表达率可由44.21%升高至79.80%;转染兔软骨细胞和成纤维细胞、猪骨髓基质干细胞和脂肪干细胞后,均可见GFP阳性表达明显增强。结论逆转录病毒与VSV-G共转染GP2-293包装细胞可以制备出高滴度的假病毒液。浓缩病毒液的高转染率为其在组织工程种子细胞标记方面的广泛应用奠定了基础。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

Aggrecan Northern探针的构建及其在组织工程研究中的应用

目的：构建猪aggrecan探针，用于对组织工程化软骨及软骨细胞中aggrecan mRNA表达水平的Northern检测。方法：取猪软骨细胞，RT—PCR扩增aggrecan球间区域(IGD)片段。将纯化的RT—PCR产物克隆入pUCm—T载体，酶切、测序鉴定。32P标记aggrecan探针，Northern杂交法检测组织工程化软骨和软骨细胞中aggrecan mRNA的表达状况。结果：构建产物经鉴定，证实其包含了猪aggrecan IGD的基因序列。Northern结果显示，该探针可用于对组织和细胞中aggrecan mRNA表达水平的柃测。结论：在组织工程化软骨的研究中，利用Northern杂交法对样品中aggrecan mRNA的水平进行检测，具有良好的灵敏度、可信度和特异性。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.