4种品系小鼠角质形成细胞原代培养比较研究

目的 体外分离、培养并鉴定成年小鼠背部皮肤角质形成细胞(KC);对比4种品系小鼠KC的增殖与分化能力。方法 剪取4种品系成年小鼠背部皮肤,剥离皮下脂肪组织,0.25%胰蛋白酶消化获得KC;免疫荧光法鉴定KC;显微镜下观察细胞生长状况;设计不同的种板时间和密度,使用CCK-8法、EdU和高内涵法检测细胞增殖活力;通过Western blot检测4种成年小鼠KC分化情况。结果 对4种品系成年小鼠背部相同面积的皮肤组织进行胰蛋白酶消化,昆明(Kunming, KM)小鼠提取的KC数量最低,C57BL/6提取的细胞数量最多;BALB/c、KM、裸小鼠分别以8×10³个/孔的密度铺板增殖效率较高,C57BL/6以1.6×10⁴个/孔的密度铺板增殖效率较高;4种品系小鼠,BALB/c小鼠原代KC较C57BL/6小鼠原代KC增殖能力弱,分化程度差异无统计学意义。结论 采用简便易行的方法成功分离并比较4种成年小鼠背部皮肤原代KC的增殖和分化能力,为皮肤相关疾病模型小鼠的品系选择提供一定实验依据。     

人源GRK2的真核表达、纯化及活性检测

目的 构建人源G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)真核表达系统。方法 设计引物,以pIRES-EGFP-GRK2(全长)基因为模板,PCR扩增His-GRK2目的基因,将His-GRK2目的基因连接在pcDNA3.1-EGFP真核表达载体上;将pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2质粒转染至HEK 293T细胞,48 h后采用Western blot法检测GRK2蛋白表达,通过镍螯合的磁珠法纯化GRK2蛋白,考马斯亮蓝染色和Western blot法检测GRK2蛋白纯化,His pull down检测GRK2蛋白活性。结果 双酶切和测序鉴定结果表明,pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2真核表达质粒成功构建;Western blot法检测结果表明,GRK2蛋白的分子量约为80 ku,提示GRK2蛋白在HEK 293T细胞中成功表达(t=6.433,P=0.003);通过镍螯合的磁珠纯化得到GRK2蛋白,His pull down实验结果表明GRK2与前列腺素E2受体4亚型(EP4)结合,提示GRK2蛋白具有生物学活性(t=13.5,P=0.000 2)。结论 pcDNA3.1-...     

采用慢病毒载体干扰TRAF2表达的MH7A细胞稳转株的构建及意义

目的 用慢病毒载体构建干扰肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)表达的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞株MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号在MH7A异常增殖的作用。方法 根据人TRAF2的基因序列和shRNA序列设计原则,设计并合成3对TRAF2-shRNA干扰序列,通过PCR对引物进行退火,通过双酶切PLKO.1-puro获得线性载体,将线性化载体与退火后引物通过Solution I连接,连接产物导入感受态细胞,涂板,挑取阳性菌落进行测序。构建3种不同的PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒重组质粒,借助慢病毒包装质粒对对数生长期的HEK 293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液感染MH7A细胞,同时使用嘌呤霉素对TRAF2低表达的MH7A稳转株进行筛选。使用CCK-8法、Western blot、qPCR检测MH7A中肿瘤坏死因子TNF-α诱导TRAF2低表达的MH7A增殖功能及下游信号TRAF2、P65蛋白表达和mRNA水平。结果 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1)、PLKO.1-TRAF2-shRNA(2)和PLKO.1-TRAF2-shR...