枸杞多糖对外周血单核细胞激活作用

目的:探讨枸杞多糖对外周血单核细胞是否具有激活作用。方法:贴壁法分离培养外周血单核细胞并进行鉴定。应用中性红实验检测枸杞多糖对单核细胞吞噬作用;用非特异性酯酶染色及电镜技术检测枸杞多糖诱导单核细胞内溶酶体的改变;用0.312,1.250,5.000g.L-1枸杞多糖对体外培养的外周血单核细胞进行诱导培养12h,ELISA法测定单核细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的表达。结果:枸杞多糖能增强单核细胞的吞噬作用,增加单核细胞胞质内溶酶体量,显著诱导单核细胞表达TNF-α和IL-6。结论:枸杞多糖对单核细胞具有激活作用。     

人前列腺特异性抗原mRNA实时荧光POR定量标准品的构建

目的 构建实时荧光定量PCR（FQ-PCR）的标准品以定量检测人前列腺特异性抗原（PSA）mRNA的表达。方法 以Trizol裂解抽提法提取LNcaP细胞的总RNA。以RT-PCR法制备PSAcDNA目的片段并进行扩增；以A-T载体克隆法制备重组质粒，并转化EcoliDH5。菌提取重组质粒，联合用氨苄青霉素筛选法和筛选法、EcoRI限制性酶切和序列分析法鉴定特异性重组质粒。用聚乙二醇沉淀法提纯质粒并检测）．260nm吸光度，确定原液的重组质粒的拷贝浓度并以此制备FQPCR梯度标准品。结果 PSAcDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒。保持了目的片段的特异性和序列的完整性。结论 成功构建了实时荧光定量PCR标准品。     

牛膝多糖对外周血单核细胞的激活作用

目的探讨牛膝多糖对外周血单核细胞是否具有激活作用。方法分别应用中性红试验检测牛膝多糖（1．250mg／ml）对单核细胞吞噬作用的影响；非特异性脂酶染色及电镜技术检测牛膝多糖（1．250mg／ml）诱导单核细胞内溶酶体的改变；0．312、1．250、5．000mg／ml牛膝多糖对体外培养的外周血单核细胞进行诱导培养12h，ELISA法测定单核细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的表达。结果牛膝多糖能增强单核细胞的吞噬作用，增加单核细胞胞质内溶酶体量，显著诱导单核细胞表达TNF-α和IL-6。结论牛膝多糖对单核细胞具有激活作用。     

HLA-DRα基因片段TA克隆载体的构建

目的应用TA克隆技术构建含HLA-DRα基因的载体，作为实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HLA-DRα基因的标准模板。方法利用RT-PCR法，从提取的外周血单核细胞总RNA中特异地扩增含635bp的HLADRα cDNA片段，并将其克隆到TA载体。结果用限制性内切酶法和测序方法证实扩增片段为目的片段。结论成功地构建了HLA-DK基因片段TA克隆载体。为实时荧光定量RT-PCR法检测HLA-Dα,mRNA表达提供标准模板。     

牛膝多糖诱导单核细胞HLA-DRαmRNA表达的实验研究

目的：研究单核细胞的分离培养并检测牛膝多糖(ABPS)诱导单核细胞HLA-DRαmRNA的表达变化。方法：采集健康成人的血液,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,用贴壁法分离单核细胞．接种细胞到24孔板,同一时间不同ABPS浓度或同一浓度ABPS不同时间37℃、5％CO2培养．RTPCR检测HLA-DRαmRNA表达水平并且进行PCR产物验证。结果：(1)鉴定单核细胞：在PBMC中,流式细胞术检测到CDl4阳性细胞占12.0％,黏附得到的单核细胞中,流式细胞术检测到CD14阳性细胞占83.1％．(2)同一时间不同浓度ABPS上调HLA-DRαmRNA表达。(3)不同时间同一浓度ABPS上调HLA-DRαmRNA表达。(4)引物序列和产物序列分别进行BLAS7表明PCR产物为NM_019111。结论：在体外,ABPS上调单核细胞HLA-DRαmRNA,有显着的剂量和时间效应关系．提示ABPS能激活单核细胞并有增强免疫功能。     

枸杞多糖调节单核细胞功能探讨

目的观察枸杞多糖(LBP-X)调节单核细胞功能的机理。方法依据本课题前期的研究方法获得外周血单核细胞,并用不同浓度LBP-X(0.000、0.312、1.250、5.000 mg/mL)诱导培养。中性红和MTT实验分别分析LBP-X诱导单核细胞的吞噬和增殖作用;同时,LBP-X诱导单核细胞分泌溶菌酶、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6),并检测;用Western Blot法检测LBP-X诱导单核细胞抗原呈递分子人白细胞抗原DR(HLA-DR)表达。结果 LBP-X增强单核细胞的吞噬作用(P0.05,P0.01),且增加单核细胞溶菌酶、TNF-α和IL-6的分泌(P0.05,P0.01),但对单核细胞增殖没有影响(P0.05);LBP-X增强单核细胞HLADR的表达(P0.05,P0.01)。结论 LBP-X激活单核细胞,且可能增强单核细胞的抗原呈递功能。     

LPS诱导小鼠肺微血管内皮细胞VEGF表达的探讨

目的：研究小鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法并探讨脂多糖(LPS)诱导小鼠肺微血管内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达．方法：贴块法培养小鼠肺微血管内皮细胞,并进行系列鉴定．采用ELISA方法检测正常组、LPS(1μg／ml)作用2、8、16、24、36、48h组的VEGF变化水平。结果：获得的小鼠肺微血管内皮细胞具有鹅卵石形态,但LPS对小鼠肺微血管内皮细胞形态影响明显。对异植物血凝素结合试验,CD31及Ⅷ因子抗原免疫组化染色为阳性。LPS(1μg／ml)分别作用小鼠肺微血管内皮细胞2h组可见VEGF表达升高,8h组达最高,16、24、36、48h组的表达量低于8h组。结论：LPS作用后,小鼠肺微血管内皮细胞VEGF表达呈抛物线型下降。LPS损伤内皮细胞功能和形态。     

人肿瘤坏死因子真核表达探讨

目的:研究人肿瘤坏死因子真核表达.方法:重组质粒(pORB2TNF-α)和线性杆状病毒(AcNPV)共转染昆虫细胞系(sf21),裂解转染细胞,ELISA方法蛋白定位,裂解物电泳评价杆状病毒重组体(AcNPV-pORB2TNF-α)表达蛋白;用6 χ His标签纯化蛋白,纯化蛋白进行蛋白印迹(Western blot).结果:转染细胞表达蛋白为可溶蛋白;转染AcNPV-pORB2TNF-α细胞裂解物电泳见35kD Xy1E蛋白条带;纯化蛋白电泳可见17kD蛋白条带并且Western blot呈阳性.结论:用构建人肿瘤坏死因子杆状病毒重组体,成功表达TNF-α蛋白.     

实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测HLA-DRα基因mRNA表达

目的 建立实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HLA-DRα基因mRNA表达。方法应用T-A克隆技术构建含HLA-DRα基因的载体作为标准模板,采用荧光Taqman方法及探针标记技术,建立实时荧光定量RT-PCR方法,制备标准曲线,检测牛膝多糖（ABPS）诱导人外周血单核细胞的HLA-DRα mRNA表达水平变化,并与半定量RT-PCR检测结果进行比较。结果实时荧光定量RT-PCR检测ABPS诱导人外周血单核细胞实验组HLA-DRα mRNA表达明显升高,而无ABPS诱导人外周血单核细胞对照组HLA-DRα mRNA表达没有改变,且半定量RT-PCR结果显示HLA-DRα出现类似的变化趋势。结论所建立的实时荧光定量RT-PCR用于检测HLA-DRα mRNA表达,结果用拷贝数表示,比半定量RT-PCR更灵敏、准确。     

Salusin-α转染血管平滑肌细胞对ACAT1和SA-R表达的调节作用

目的:探讨Salusin-α基因转染血管平滑肌细胞对乙酰辅酶A乙酰转移酶1(ACAT1)及清道夫受体(SA-R)表达的影响。方法:构建pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP(EGFP为绿色荧光蛋白)和psiHIV-U6-Salusin-α质粒(psiHIV-U6为慢病毒RNA干扰载体)。分别转染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP质粒和psiHIV-U6-Sa-lusin-α质粒至氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导培养的血管平滑肌细胞(VSMCs),并设置对照组,于37℃5%CO2培养箱中培养48h后,用Western-blotting方法检测ACAT1及SA-R的表达。结果:成功构建pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP和psi-HIV-U6-Salusin-α质粒。转染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP入VSMCs,Salusin-α表达增加,ACAT1表达降低(P<0.05)。转染psiHIV-U6-Salusin-α入VSMCs,Sa-lusin-α降低表达,ACAT1表达增加(P<0.05)。同时转染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP和psiHIV-U6-Salusin-α入VSMCs,Salusin-α和ACAT1表达均无显著性变化(P>0.05)。Salusin-α表达增加或降低对SA-R的表达均无明显影响(P>0.05)。结论:Salusin-α可下调ACAT1表达,可能具有抗动脉粥样硬化的作用。