金葡菌肠毒素SEC2的抗体制备及应用

生产厂家以金葡菌肠毒素C2(SEC2)的标示量作为金葡素注射液的质量控制标准，但其真正的含量由于滤液成分复杂而很难检测，本实验试图建立一种方便的鉴定金葡素注射液中的SEC2的方法。首先将重组的SEC2分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔，制备并纯化了单克隆及多克隆抗体。采用自制的抗体建立了检测SEC2的生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附实验，检测目标蛋白的质量浓度范围为2～20 ng·mL^-1，在检测范围内检测值的平均变异系数为5.08%，采用本法检测质量浓度分别为100 ng·mL^-1的重组肠毒素(SEA/SEO/SEM/SEN/SEG/SEI)，均呈现阴性反应，说明此检测方法的专一性较好。采用此方法对金葡素注射液中的SEC2含量进行了检测，发现SEC2标识量与实际含量存在一定的差距。     

抑癌基因ING2真核表达质粒的建立及其对肺癌细胞生长的影响

目的 构建抑癌基因生长抑制因子2(ING2)真核表达载体,研究p33ING2对人肺腺癌细胞A549及人小细胞肺癌细胞NCI-H446体外生长的影响.方法 构建ING2基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-ING2,采用脂质体法分别转染A549和NCI-H446细胞,以未转染组和转染pcDNA3.1(+)空质粒组作为对照,应用RT-PCR、细胞免疫组化和Western blot法分析目的基因及其蛋白表达,CCK8试剂盒分析其对细胞生长的影响,Annexin V-FITC和PI双染流式细胞术观察细胞凋亡的情况.结果 成功构建了重组真核表达载体pcDNA3.1(+)- ING2,转染后细胞株高水平表达ING2 mRNA及p33ING2蛋白.CCK8法检测结果显示:转染pcDNA3.1(+)-ING2的A549细胞和NCI-H446细胞增殖受到抑制,抑制率与pcDNA3.1(+)空质粒转染组比较,差异有统计学意义(P<0.01).流式细胞术凋亡检测结果显示:转染pcDNA3.1(+)-ING2的A549细胞和NCI-H446细胞组凋亡率均高于未转染组和pcDNA3.1(+)空质粒转染组,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 ING2蛋白表达能抑制人肺腺癌细胞A549和人小细胞肺癌细胞NCI-H446增殖及增加细胞凋亡率.     

临床肿瘤治疗药物相关基因的研究进展

肿瘤化学药物治疗已经在临床上得以广泛应用，但患者对各类治疗药物的敏感性和不良反应存在明显个体差异，药物相关基因指导下的临床肿瘤药物的个体化治疗是肿瘤治疗最重要的发展方向之一。本文主要介绍了5个与临床抗肿瘤药物疗效及毒性相关的基因：二氢嘧啶脱氢酶(DPD)基因突变与5-氟尿嘧啶(5-Fu)的毒性反应；表皮生长因子受体(EGFR)突变与非小细胞肺癌(NSCLC)中吉非替尼、特罗凯的疗效；核苷酸切除修复酶1(ERCC1)基因多态性与铂类化合物疗效；UDP葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)的遗传变异与羟基喜树碱的毒性反应；胸腺酸合成酶(TS)基因多态性与5-Fu的敏感性，探讨如何预测肿瘤治疗药物的敏感性及不良反应，以指导临床个体化用药。     

金黄色葡萄球菌肠毒素E的克隆表达及其生物活性研究

 目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)基因,获得重组SEE蛋白(rSEE),并对rSEE进行生物活性分析。方法通过PCR从金黄色葡萄球菌FR1326菌株基因中得到肠毒素SEE的成熟肽基因,将其克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌进行表达并对融合蛋白进行亲和色谱纯化,通过MTF法研究其生物活性。结果成功构建了SEE的表达载体,并得到高纯度的重组蛋白。MTY法结果表明,rSEE具有良好的促淋巴细胞增殖的能力以及肿瘤细胞的杀伤活性。结论具超抗原活性和高纯度的rSEE,为进一步研究该蛋白的抗肿瘤机制,构建靶向抗肿瘤融合蛋白奠定了基础。     

婴儿健脾散中川贝母荧光PCR检测方法的建立及应用

目的 探讨双重实时荧光PCR检测方法对婴儿健脾散中川贝母成分真伪鉴别的可行性。 方法 使用特异性Taqman引物和探针建立双重荧光PCR检测法，对川贝母及其常见伪品进行鉴别，并对其灵敏度、特异性和自制模拟婴儿健脾散处方进行评估。进一步使用该方法对市场流通的婴儿健脾散中的川贝母真伪进行检测。结果 建立的双重实时荧光PCR检测方法特异性高，灵敏度达0.0001ng/μL；对49批婴儿健脾散样品抽查检出6批不合格，其中2批未检出贝母属成分，4批检出贝母属成分但未检出川贝母成分。结论 本双重实时荧光PCR法可成功鉴定婴儿健脾散中川贝母的真伪，可为含川贝母成分复方制剂的川贝母真伪鉴别提供依据。     

金黄色葡萄球菌肠毒素SEC2的纯化与活性研究

从金黄色葡萄球菌发酵液中纯化金黄色葡萄球菌肠毒素C2（SEC2）。发酵液经超滤浓缩、硫酸铵沉淀、阴离子交换色谱和分子筛色谱，获得了纯度为90％的SEC2，总收率23％。体外刺激脾淋巴细胞增殖实验以及体外肿瘤细胞增殖抑制试验表明该蛋白具备良好的超抗原活性。     

重组金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 的表达及生物学活性分析

目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因,添加亲和纯化标签进行原核表达,并对表达产物进行生物学活性分析.方法 通过PCR从pGEM-T-SEC2质粒中亚克隆得到带有编码6个组氨酸的核苷酸序列的基因片断,构建了表达质粒pET-28a-SEC2,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达.利用亲和层析纯化rSEC2,并采用MTT法对纯化后的rSEC2和天然SEC2生物学活性进行研究和比较.结果 表达质粒pET-28a-SEC2通过测序,表明已连入正确表达目的蛋白的核苷酸序列.含有该质粒的表达菌株经IPTG诱导,产生约占菌体总蛋白40%的可溶性重组蛋白.SDS-PAGE显示,经Ni2 亲和柱纯化的目的蛋白达到了电泳纯.MTT法表明该rSEC2和天然SEC2均有显著的超抗原活性.结论 成功构建了pET-28a-SEC2表达质粒,获得了与天然SEC2有着类似超抗原活性的高纯度rSEC2,为进一步研究该蛋白的抗肿瘤活性奠定了基础.     

复可托产品及原料中6种猪病毒基因膜芯片检测方法研究

目的 利用基因膜芯片技术建立复可托产品及原料中6种猪病毒快速检测方法。方法 设计6种猪病毒特异性引物及探针,对样本核酸进行多重PCR扩增,进一步利用基因膜芯片技术进行产物杂交并分析判定。结果 建立的检测方法特异性强,稳定性好,灵敏度高,综合检测限为1.0×10⁵ copies·mL^-1,满足日常检验要求。结论 建立了6种猪病毒PCR-基因膜芯片技术的快速筛查方法,可保障复可托产品及原料的质量安全,该技术可进一步应用于养殖场和市场的猪肉检测,为政府监管部门提供有力的技术支撑。     

基于水凝胶的基因组DNA固定法研究

目的：通过对人基因组DNA固定化的研究,探讨特异性高的单点共价固定方法,实现对人基因组DNA的反复利用。
方法：选取Mirzabekov等发明的DNA-水凝胶共聚化学法作为基因组DNA固定方法,使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,以(CH2)6-NH2氨基末端修饰的PCR产物及甲酸随机断裂修饰的pGEM-T-HLA-G质粒为模板,使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其固定效率,并通过PCR法检测该固定方法的热稳定性。将该法初步应用于人类基因组DNA的固定和反复利用,对基因组DNA扩增的片段进行测序,排除突变可能。
结果：使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,实现了对质粒DNA以及人基因组DNA的固定和反复使用,该方法可以经受16轮的PCR扩增（每轮36个循环）。测序结果证实基因组DNA的扩增片段未发生突变。
结论：甲基丙烯酰胺凝胶法固定DNA的热稳定性好,特异性高,可用于全基因组测序及SNP检测。     

金葡菌肠毒素C2的克隆表达及其生物学活性

目的克隆金葡菌肠毒素C₂全长基因，构建SEC₂的表达载体，实现其可溶性表达，并对纯化的rSEC₂蛋白的生物学活性进行研究。方法通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)从金葡菌FRI1230菌株基因中得到肠毒素SEC₂的基因，将其克隆至融合表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌进行表达并对融合蛋白进行亲和色谱纯化。通过考察重组SEC₂对淋巴细胞的增殖作用及其对肿瘤细胞杀伤活性的影响，对其超抗原活性和免疫学活性进行研究。结果得到正确的肠毒素SEC₂基因序列并得到高效表达的融合蛋白，MTT法结果表明，重组SEC₂表现出良好的促淋巴细胞增殖活性，且能够增强淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结论本研究成功克隆了SEC₂基因，表达并纯化出具有抗肿瘤生物学活性的重组SEC₂蛋白，为进一步对其分子抗肿瘤作用机制进行研究以及构建靶向抗肿瘤融合蛋白奠定了基础。