嘌呤霉素损伤小鼠肾小球足细胞系中podocin表达与分布的影响及其意义

目的Podocin是构成肾小球足细胞裂孔隔膜（slit diaphragm，SD）完整性的重要分子，其表达异常与大量蛋白尿的形成有关。本研究采用体外培养肾小球足细胞系，探讨足细胞损伤过程中，podocin mRNA表达和分布变化与足细胞损伤的关系。方法将体外培养的足细胞采用随机数字表法设立为实验组与对照组。实验组采用嘌呤霉素（puromycin aminonucleoside，PAN）刺激（剂量为50μg／mL），分别于8h，24h和48h观察细胞形态、提取总RNA和细胞免疫组化观察podocin的分布。对照组用含10％FBS的RPMI 1640培养液培养。细胞图像应用Image J图像处理软件，计算实验组与对照组在上述各时间点200倍镜下随机选择的30个细胞的相对面积，半定量RT—PCR和间接免疫荧光法检测podocin mRNA表达和分布变化。结果对照组呈星形伸出树枝状突起，相邻细胞间形成相互连接。实验组细胞体缩小，足突回缩、消失，细胞间失去相互连接。上述各时间点两组间podocin mRNA表达比较，差异无显著意义（P〉0．05）。Podocin在对照组呈细丝状均匀分布于细胞核膜、细胞质及细胞膜；在实验组主要沿细胞核膜呈点线样分布，刺激后8h和24h细胞质有少许分布，刺激48h后出现细胞膜、细胞质分布缺失。结论Podocin分布异常与足细胞损伤密切相关，损伤早期即有变化；podocin分布异常是足细胞损伤过程中的重要分子效应。     

nephrin分子在多柔比星肾小球硬化大鼠模型中的表达

目的建立多柔比星肾小球硬化大鼠模型,通过检测nephrin分子表达探讨nephrin分子在肾小球硬化中的作用。方法清洁级雄性SD大鼠48只。体质量（200±20）g。随机分为模型组30只和对照组18只。模型组鼠尾静脉注射多柔比星5mg/kg,7d后重复尾静脉注射多柔比星3mg/kg建立大鼠肾小球硬化大鼠模型;对照组在对应时间点注射9g/L盐水。分别留取6和8周模型及对照组各6只大鼠尿液、血液及肾脏标本,分别检测24h尿蛋白、血生化,并进行肾脏光镜、电镜检查,提取肾脏RNA进行荧光定量PCR检测nephrin表达量。结果第6和8周模型组大鼠尿蛋白明显较对照组增加,血清清蛋白明显减低,BUN、Cr及血清胆固醇明显增高。肾脏病理在第6周时出现局灶肾小球硬化,第8周时呈典型肾小球硬化。模型组大鼠nephrin表达在第6和8周时明显较对照组增高,分别为对照组的3.85和6.15倍。结论nephrin分子在肾小球硬化大鼠模型表达明显增加,提示nephrin分子与蛋白尿发生与发展密切相关,并有可能参与肾小球硬化进展。     

银杏内酯B对大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1及细胞外基质分泌的影响

目的观察银杏内酯B对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(MC)转化生长因子β1(TGF-β1)基因表达及纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)分泌增加的抑制作用。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分为对照组、LPS刺激组、银杏内酯B高、中、低剂量组,分别于6、12、24h后ELISA法测定细胞培养上清液中TGF-β1、FN、LN、ColⅣ蛋白含量,荧光半定量RT-PCR法检测TGF-β1基因表达的变化。结果正常培养的大鼠肾小球系膜细胞可分泌一定量的FN、LN、ColⅣ及TGF-β1,LPS刺激后各成分分泌量均明显增加,银杏内酯B高、中、低剂量组在各个时间点相对于LPS刺激组各观察指标均受不同程度的抑制,并且银杏内酯B可抑制LPS刺激后TGF-β1mRNA的增高表达,而且这种抑制作用呈现剂量依赖效应。结论银杏内酯B能够抑制LPS刺激引起的系膜细胞分泌细胞外基质的增加,这种抑制作用可能通过TGF-β1调节。     

福辛普利对大鼠肾小球系膜细胞β1整合素表达及细胞外基质分泌的影响

目的观察福辛普利(fosinopril,FOS)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(GMC)β1整合素表达及分泌细胞外基质(ECM)的影响。方法大鼠GMC原代体外培养,鉴定3～10代后用于实验。实验分为5组:对照组、LPS刺激组(LPS)、FOS高、中、低剂量组(分别为FOS1组、FOS2组、FOS3组)。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定6、12和24 h细胞培养上清液中ECM层黏连蛋白(LN),纤维连接蛋白(FN)和Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)含量;荧光半定量RT-PCR检测β1整合素mRNA表达。结果体外培养的大鼠GMC可分泌一定量的ECM,在各时间点,LPS组GMC的ECM分泌均高于对照组(P<0.01),而FOS各组GMC的ECM分泌均低于LPS组(P<0.01);体外培养的大鼠GMC可表达一定量的β1整合素mRNA,在各时间点,LPS组GMC的β1整合素mRNA表达量均高于对照组,FOS各组GMC的β1整合素mRNA表达量均低于LPS组。结论 LPS可诱导大鼠GMCβ1整合素表达及ECM分泌增加,而FOS可抑制LPS诱导的大鼠GMCβ1整合素表达及ECM分泌增加,FOS可以通过抑制细胞因子及ECM分泌等非血流动力学机制对肾脏起保护作用。     

Podocin与nephrin在多柔比星诱导肾病大鼠模型肾皮质部的表达及共定位分布

目的观察podocin与nephrin在多柔比星诱导肾病（adriamyciwinducing nephrotic,ADN）大鼠模型病变过程中的表达及共定位分布,探讨podocin和nephrin在肾病病变过程中的作用机制。方法将60只雄性Spraque-Dawley（SD）大鼠分为模型组（尾静脉注射6．5mg／kg多柔比星,n=30）和对照组（尾静脉注射0．8mL生理盐水,n=30）。分别于造模后的第1、第2、第4、第6和第8周末处死大鼠,并观察各项指标的变化：①24h尿蛋白定量,血浆白蛋白、血胆固醇、血肌酐和血尿素氮水平;②两组上述各时间点取肾皮质进行光镜和电镜检测;③采用双标准曲线法进行荧光定量PCR检测肾皮质部podocin mRNA和nephrin mRNA表达;④应用双重免疫荧光法观察肾小球podocin和nephrin的共定位分布。结果①模型组大鼠出现大量蛋白尿、低白蛋白血症、高脂血症,肾功能减退,表现为典型的肾病综合征;模型组病理改变由微小病变逐渐发展至局灶节段性肾小球硬化,电镜下可见足细胞在病变早期出现足突增宽、融合,晚期足突消失、细胞核固缩;②模型组podocin mRNA表达第1周末时升高95．8％（P〈0．01）,第2周末时升高252．5％（P〈0．01）且达高峰,第4周末时开始下降27．6％（P％0．05）,第6和第8周末分别下降52．9％和48．0％,与对照组比较,差异有显著意义（P〈0．01）。模型组nephrin mRNA表达第1周末时升高140．8％（P〈0．05）且达高峰,第2周末时持续升高80．4％（P〈0．05）,第4、第6和第8周末时分别下降39．2％,47．5％和52．5％,与对照组比较,差异有显著意义（P〈0．01）。③模型组免疫荧光染色可见podocin与nephrin在大鼠肾小球内分布,且随病变进展而增加,由正常的沿肾小球血管襻呈均匀线性分布转变为呈不连续分布,而且重叠程度减少。结论Podocin和nephrin在多柔比星肾病大鼠肾病进展过程中出现表达及分布异常,导致两者不能形成正常的复合体结构,这可能是蛋白尿发生的重要分子机制。     

免疫吸附疗法在2例儿童重症狼疮性肾炎中的应用

目的 探讨DNA免疫吸附治疗在儿童系统性红斑狼疮(SLE)合并狼疮性肾炎(LN)的临床疗效和安全性.方法 对2例重症系统性红斑狼疮合并狼疮性肾炎患儿采用DNA免疫吸附疗法(DNA-IA)进行4次免疫吸附治疗,观察其临床表现的改善,对抗核抗体(ANA)、抗双链DNA 抗体(ds-DNA)等自身抗体的清除效果,对免疫球蛋白、血清补体、肝肾功能、心肌酶谱、血清离子的影响,观察血常规、尿常规和24 h尿蛋白定量的变化.结果 DNA免疫吸附治疗后患儿的症状和体征均明显改善,ANA抗体滴度和抗ds-DNA抗体滴度明显下降(P＜0.01),其他自身抗体也被清除,血清补体有上升趋势,24 h尿蛋白定量明显下降,肾功能改善,肝功能、心肌酶谱和血清离子等均有改善.结论 DNA免疫吸附疗法能够在短时间内清除重症SLE患儿体内ANA抗体和抗ds-DNA等免疫抗体,控制狼疮活动,改善肾功能,减轻蛋白尿.此技术安全有效,无明显不良反应,值得临床应用.     

地塞米松通过稳定podocin的表达和分布抑制嘌呤霉素对小鼠肾小球足细胞的损伤

目的 观察嘌呤霉素（PAN)和地塞米松（DEX）对足细胞分子podocin表达和分布的影响,探讨DEX改善蛋白尿的机制。 方法 体外培养小鼠足细胞（MPC5）,分为对照组、PAN组和DEX组。对照组用含0.02% DMSO的RPMI-1640培养液培养;PAN组加入PAN;DEX组同时加入PAN和DEX。处理后8 h、24 h和48 h,观察细胞形态并摄像,用图像处理软件分析各组细胞形态及胞体面积的差异。用RT-PCR、Western印迹和间接免疫荧光染色检测各时间点podocin mRNA和蛋白的表达及分布。 结果 正常足细胞呈星形,胞体大并有树样突起,细胞相互连接。PAN刺激8 h,足细胞胞体面积缩小,为对照组的43%;24 h为10%;48 h为5.7%（P < 0.01）;部分足细胞足突及细胞连接消失。DEX组在8 h、24 h和48 h,足细胞胞体面积显著大于PAN组,分别为对照组的43.9%、26.2%及29.6%（P < 0.05）, 足突形态正常。PAN组podocin mRNA表达量呈下降趋势,蛋白表达量显著降低（P < 0.01）,分布异常。DEX组podocin mRNA和蛋白的表达量及分布与对照组相似,48 h时mRNA和蛋白的表达量均显著高于PAN组（P < 0.05）。 结论 DEX直接作用于足细胞,稳定podocin mRNA和蛋白的表达量及分布,该作用可能与其能保护足细胞及改善蛋白尿有关。     

Podocin在阿霉素肾病大鼠模型肾皮质部表达及分布的时相变化

目的动态观察足细胞相关分子podocin在阿霉素肾病大鼠模型肾皮质部的表达及分布的时相变化,探讨podocin分子在蛋白尿发生发展过程中的作用。方法建立阿霉素大鼠肾病模型,实验分为模型组(阿霉素肾病大鼠24只)和对照组(正常大鼠24只)。观察1、2、4和6周各项指标的变化,包括24h尿蛋白定量、血浆白蛋白(Alb)和总胆固醇(TC)检测,光镜下观察肾组织病理改变,采用Western blot检测肾皮质部podocin的蛋白表达,采用荧光定量PCR检测肾皮质部podocin的mRNA表达,应用免疫荧光法观察podocin在肾组织中的分布。结果阿霉素肾病大鼠模型组蛋白尿持续增加,并出现低白蛋白血症、高脂血症,表现为典型的肾病综合征;模型组由微小病变逐渐发展至局灶节段性硬化;模型组podocin在肾皮质部的蛋白表达2周时开始增高,4周时明显增高,6周时仍维持在较高水平;模型组podocin在肾皮质部的mRNA表达1周时开始增高,2周时明显增高,4周后较对照组下降;模型组podocin荧光染色由正常的沿肾小球血管襻呈均匀线性分布转变为呈不连续颗粒状分布,且分布异常并进行性加重。结论Podocin在阿霉素肾病大鼠模型中蛋白和mRNA表达变化的时相不同,并且分布异常是发生蛋白尿的关键因素,推测podocin可能参与肾病病程进展的内在分子机制。     

Podocin在多柔比星肾病大鼠模型中的表达及意义

目的建立多柔比星肾病（ADN）大鼠模型，观察足细胞相关分子podocin在模型不同病理时期mRNA的表达，探讨podocin分子在肾病发生发展过程中的作用。方法雄性sD大鼠48只[体质量（230&#177;20）g，月龄2～3个月]，随机分为模型组和对照组，每组24只。模型组鼠尾静脉注射多柔比星6．5mg／kg，建立ADN模型。对照组注射9g／L盐水。分别于第2、4、6、8周每组各处死大鼠6只。处死前1天收集24h尿液，检测24h尿蛋白，应用光镜和电镜观察各组肾组织病理改变，Trizol法提取肾皮质总RNA，采用实时荧光定量反转录PCR检测其各时间点肾组织podocin mRNA表达。结果模型组大鼠实验第2、4、6、8周均表现为大量蛋白尿，各时间点24h尿蛋白较对照组均明显升高（P。〈0．01），模型组大鼠肾组织病理在肾病早期表现为微小病变型，随着病情进展，第6—8周呈现局灶性节段性肾小球硬化病理表现；电镜下可见模型组随着病变进展，足细胞损伤进行性加重。在病变早期可见足突增宽、融合，晚期足突消失，核固缩等表现。模型组第2周。肾组织podocin分子mRNA表达明显升高（P〈0．01），第4周时下降，第6—8周进一步下降（Pa〈0．05）。结论Podocin分子在肾病综合征发生发展中起重要作用，podocin mRNA表达变化可能与肾病病理类型密切相关。