酵母菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因系统对人原代T细胞的作用

目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因(YCD)是新型自杀基因,利用重组逆转录病毒载体(RV),将YCD高效导入人原代T细胞,并在体内外探讨转基因T细胞的功能及"自杀"效应。方法:构建RV载体MSCV-YCD-puroR,瞬时质粒共转染法制备RV,流动感染法或Retronectin 离心法感染人原代T细胞,嘌呤霉素筛选获得T-YCD-puroR,检测转基因T细胞对肿瘤细胞的杀伤及细胞因子分泌功能,在体外和SCID小鼠体内,探讨前体药物5氟胞嘧啶(5-FC)对T-YCD-puroR细胞的杀伤效应等。结果:病毒滴度为(5.0±3.7)×106TU/mL。流动转染法对人原代T细胞的基因导入率46.0%±9.6%,2轮离心 Retronectin法的基因导入率为60.3%±7.6%(n=3)。经嘌呤霉素筛选48h获得T-YCD-puroR细胞,其基因阳性率96.7%±1.5%,并可大量扩增。与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞杀伤K562肿瘤细胞的能力及细胞因子分泌功能无统计学意义。体外实验显示,与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞对puromycin的IC50上升了304.9倍(0.071mg/Lvs22.3mg/L),对5-FC的IC50下降了133.3倍(656.0μmoL/Lvs4.9μmoL/L)。T-YCD-puroR细胞静脉接种于SCID小鼠,7d后每只小鼠腹腔注射5μmoL的5-FC,连续7d,首次给药24h后即可观察到SCID小鼠外周血中CD45 细胞显著下降(P<0.01)。结论:YCD自杀基因导入对人原代T细胞功能无显著影响,T-YCD-puroR细胞可以在体内外被5-FC有效杀伤。本研究为进一步研究打下了良好的基础。     

梅毒血清学RPR前带现象的纠正

梅毒血清学ＲＰＲ (快速血浆反应素环状卡片试验 )检查 ,试剂稳定 ,操作简便 ,结果易观察 ,己广泛应用于临床。但我们发现本法也存在着前带现象 ,使阳性结果错报成阴性 ,特做纠正试验报告如下。1　材料与方法　　标本来源为我院就诊病人 1例 ,经检验血清梅毒确正试验(ＴＰＨＡ)阳性 ,ＲＰＲ试验阴性。ＲＰＲ试剂盒购于上海荣盛生物技术有限公司。ＴＰＨＡ试剂盒为兰州生物制品研究所提供。将待检血清用生理盐水分别做 1∶2、1∶4、1∶8、1∶1 6、1∶32和 1∶64倍稀释 ,每个稀释度血清分别各取 0 0 5ｍｌ,加入卡片环中 ,观察结果。　　结果…     

Therapeutic effect of 5-FC on YCD modified murine P388 leukemia in vivo

Cytosine deaminases (CDs) in bacteria andfungi are found to deaminate prodrug 5 - FC intocytotoxic agent 5 - FU .Yeast CD (YCD) is clonedfrom Saccharomyces cerevisiae.It has been shownpreviously that YCD was more efficient inconversing5 - FC than bacterial CD(b CD) [1-3 ] .As anovel suicide gene therapy system,YCD/ 5 - Fcsystem may be promising in cancer therapy andprevention of graft versus host disease.In thepresent study,we established a P388/ DBA murineleukemia model by infusin…     

沥青烟对大鼠外周血淋巴细胞微核、Heinz氏小体及雄性大鼠生殖细胞影响的研究

沥青烟对大鼠外周血淋巴细胞微核、Ｈｅｉｎｚ氏小体及雄性大鼠生殖细胞影响的研究甘肃白银公司劳研所温丽敏，郭忠毅，杨生蓉采用作业现场煤焦油沥青（ＣＴＰ）烟浓缩物２ｍｇ／只·天，１ｍｇ／只·天，０．２ｍｇ／只·天分别对大鼠经口染毒，６天／周，共染毒９５天，...     

新型自杀基因酿酒酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因修饰供者T淋巴细胞防治移植物抗宿主病体外研究

目的将新型自杀基因——酿酒酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因(YCD)导入人T淋巴细胞,在体外证明YCD自杀基因体系的有效性,为自杀基因应用于体内防治移植物抗宿主病(GVHD)提供了理论基础。方法利用脂质体法转染包装细胞293T,分离、培养人外周血单个核细胞,病毒上清转染活化后的人T细胞,应用Pu-romycin筛选扩增,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测目的基因的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测细胞因子的分泌情况,噻唑蓝(MTT)法检测其对前体药物的敏感性。结果通过高速离心富集RV、CH-296包被+离心感染法等,对经高效扩增的人T淋巴细胞基因感染率可达38.2%。RT-PCR可检测到转基因T-YCD细胞中YCD基因的表达,筛选出的转基因T淋巴细胞的细胞因子分泌无显著变化。体外实验证实转基因T淋巴细胞可被前体药物5氟胞嘧啶(5-FC)显著杀伤。结论利用pMSCV-YCD-Puro载体,可将YCD基因高效导入人T淋巴细胞,快速筛选出阳性细胞;转基因T淋巴细胞的细胞因子分泌功能未受显著影响,在体外证实导入YCD的转基因T淋巴细胞可被5-FC有效杀伤。     

批量快速测定法测定标志基因为GFP的重组病毒滴度

基因治疗若要走向临床 ,由于每批重组病毒间的差异可能很大 ,务必要建立一套简便实用的病毒滴度监控方法。而目前病毒 (尤其是逆转录病毒 )的滴度测定耗时费力 [1 ,2 ] ,或由于检测成本高而流于形式。我们建立了一套适合大批量、快速测定重组逆转录病毒 (RV )、腺病毒 (AV)等滴度的方法 ,现以增强型绿色荧光蛋白 (e GFP)标志基因为例 ,报告如下。1　材料和方法1.1　材料　 DMEM培养液 (Gibco BRL 公司 ) ;新生牛血清(NBS,杭州四季青公司 )。聚凝胺 (polybrene,Sigma公司 ) ;Fusion6转染试剂 (Roche公司 ) ;JS- 2病毒富集膜由南京…     

BsAb HER-2×CD3对过度表达HER-2乳腺癌细胞的细胞毒作用

目的 :研究应用抗HER 2抗原和CD3抗原的双向基因工程抗体BsAbHER 2×CD3介导T淋巴细胞对过度表达HER 2乳腺癌细胞的细胞毒作用。方法 :以过度表达HER 2的乳腺癌细胞株SK BR 3为靶细胞 ,T淋巴细胞为效应细胞 ,采用MTT法、3 H TdR掺入法测定BsAbHER 2×CD3对靶细胞、效应细胞的抑制作用及其介导的效应细胞对靶细胞的杀伤作用。结果 :BsAbHER 2×CD3具有MAbHER 2和MAbCD3的双重特性 ,既能抑制SK BR 3细胞生长 ,又可促进正常人外周血T淋巴细胞增殖。BsAbHER 2×CD3介导T淋巴细胞对靶细胞产生显著的细胞毒作用 ,明显强于MAbHER 2对靶细胞的作用 ,E∶T =2 0∶1为最佳效靶比。结论 :BsAbHER 2×CD3 ,既可以与HER 2过度表达的肿瘤细胞特异性结合 ,又可以介导T淋巴细胞对肿瘤细胞产生特异性杀伤作用 ,具有明显的抗肿瘤作用     

西司他丁钠+亚胺培南消除细胞培养中细菌污染的研究

目的 :研究西司他丁钠 +亚胺培南 (泰能 )清除细胞培养中细菌污染的可行性。 方法 :将 1 5批细胞培养中已发生细菌污染的细胞 ,用含泰能 1 0～ 1 0 0 μg/ ml的 PBS洗涤 3次 (PBS用量逐次递增 ) ,第 3次洗涤之前将细胞悬浮于含 1 0 0 μg/ m l泰能的完全培养液 1 .5 ml中 37℃孵育 30 min;然后细胞移入含 1 0 0 μg/ m l泰能的完全培养液中培养 ,更换含 1 0 0 μg/ ml泰能的完全培养液 1次 / d,共 3d。结果 :成功消除 1 4批细菌感染 ,另 1批加用万古霉素后亦获成功。结论 :泰能可以有效消除细胞培养中的细菌污染 ,其剂型和包装等尚可改进     

YCD基因修饰对小鼠P388白血病的体内治疗作用研究

目的：以P388/DBA小鼠白血病模型，探讨新型自杀基因YCD的体内治疗作用。方法：用逆转录病毒载体将YCD基因导入，筛选P388YCDeGFP细胞克隆，以P388eGFP和野生性（wt）P388细胞为对照。（1）3组细胞腹腔接种给DBA小鼠（n=5），5×106/只（下同），观察致病性；（2）3组细胞腹腔接种给DBA小鼠（n=5），分别以5FC治疗2周，观察疗效；（3）2组×5只小鼠腹腔接种P388YCDeGFP，5FC 5 μmol/L·d-1×2 d或PBS治疗，根据小鼠存活时间推算杀伤效率。以流式细胞仪、冰冻切片和HE切片检测各脏器中白血病细胞的分布和变化。结果：基因导入对细胞的生物学特性影响不显著；5FC治疗2周，YCD组小鼠存活(17.8±1.89) d，而eGFP组和wtP388组分别存活(7.8±1.10) d 和(7.7±1.15) d （P<005）；5FC治疗2 d的杀伤率达99.6%。结论：YCD转基因细胞在体内可被5FC有效杀灭，该系统具有应用前景。     

黄芪六一汤对2型糖尿病模型大鼠肾小管上皮葡萄糖重吸收的作用

目的:观察黄芪六一汤对糖尿病大鼠血糖、糖化血红蛋白、血脂及肾小管上皮钠-葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2)的作用,探讨该方治疗糖尿病的疗效及其可能的作用机制。方法:将77只SPF级SD大鼠按体重随机分为6组,分别为正常组,模型组,二甲双胍组(0.15 g·kg~(-1)),黄芪六一汤低、中、高剂量组(3.15,6.30,12.60 g·kg~(-1));糖尿病模型复制方法采用高脂高糖喂养28 d后,40 mg·kg~(-1)体重剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射造模。STZ注射后第7天开始分别给予相应治疗药物灌胃,正常组、模型组同法灌胃相应体积的水。连续灌胃给药治疗6周,每周1次,禁食6 h后尾静脉取血测血糖,末次给药后禁食12 h后,给大鼠进行尾静脉取血测血糖,然后麻醉大鼠,腹腔静脉取血,处死动物后留取取肾、胰腺做病理切片苏木素-伊红(HE)染色检查。观察血糖、糖化血红蛋白、血脂四项、体重、进食量、肾组织SGLT2蛋白表达等指标。结果:各造模组的血糖均高于正常组(P0.01),血糖13.0 mmol·L~(-1)。经过6周自行恢复后,模型组血糖仍显著高于正常组(P0.01);二甲双胍组、黄芪六一汤中、高剂量组血糖均明显低于模型组(P0.05)。模型组的糖化血红蛋白升高,高于正常组(P0.01),与模型组比较,二甲双胍、黄芪六一汤高剂量组糖化血红蛋白明显低于模型组(P0.05)。造模组大鼠胰腺病理切片HE染色可见胰岛结构完整,说明本实验中并未造成胰岛的完全破坏。肾脏病理切片可见,各组大鼠肾脏肾小球、集合小管、近端及远端小管的结构完整,未见明显病理损害。各给药组大鼠肾组织SGLT2蛋白表达均有所降低(P0.05,P0.01)。结论:高糖高脂饮食合并腹腔注射STZ致糖尿病大鼠模型肾组织SGLT2蛋白表达增高,黄芪六一汤能降低实验性糖尿病模型大鼠血糖、糖化血红蛋白,有降低模型大鼠肾组织中SGLT2蛋白表达的作用。部分抑制肾小管上皮葡萄糖重吸收可能是黄芪六一汤治疗糖尿病的作用之一。