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目的:应用Tet-On基因表达系统构建可调控性真核表达质粒,实现Mac-1-FP在CHO细胞中的可调控性表达.方法:采用DNA重组技术构建真核表达质粒pTRE-Tight-CFP-CD11b和pTRE-Tight-YFP-CD18(CD11b和CD18是Mac-1的两个亚基),通过脂质体介导共转染CHO细胞,用荧光显微镜观察转染后阳性细胞;应用RT-PCR和荧光强度分析观察不同浓度(0、0.01、0.1、0.5、1、2 μg/ml)强力霉素(Dox)对细胞内CD11b和CD18表达水平的影响;检测PMA(1 μg/ml)刺激前后CHO-Mac-1-FP细胞与其配基ICAM-1黏附活性的变化.结果:酶切鉴定和测序证实,已成功构建真核表达质粒pTRE-Tight-CFP-CD11b和pTRE-Tight-YFP-CD18,在荧光显微镜下观察到转染成功的CHO细胞发出青色荧光和黄色荧光.通过荧光显微镜观察到随着培养液中Dox浓度的增加,CHO细胞内的荧光强度相应增强,同时CD11b和CD18在mRNA水平的表达也随Dox浓度的增加而增加.PMA刺激后,CHO-Mac-1-FP细胞与其配基ICAM-1黏附率增高(2 h和4 h时最高,此后逐渐下降).结论:本研究成功实现了Mac-1-FP在CHO细胞中的可调控性表达并具有野生型Mac-1的黏附活性,为进一步开展单分子光谱(SMS)和荧光共振能量转移(FRET)技术研究活细胞内Mac-1分子的2个亚基的二聚化、群集、构象及与配基亲和力变化创造条件. 相似文献
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目的:通过检测衰老大鼠肝组织细胞线粒体呼吸链氧化功能。探讨大鼠衰老时肝组织细胞线粒体呼吸甸氧化功能的变化规律及941方延缓衰老的作用机制。方法:分别从4月龄(青年组)、24月龄(老龄组)和941方组大鼠的肝组织分离出线粒体,并用双缩脲法测定单位组织的线粒体蛋白,用Clark氧电极极谱法分别测定线粒体呼吸链3个氧化酶活性:NADH氧化酶(NADHOX)、琥珀酸氧化酶(SUCOX)和细胞色素氧化酶(CYTOX)。用差光谱法(联二亚硫酸钠还原减正铁氢化钾氧化的消化值)获得细胞色素a、b、c和c1含量(Cyta、Cytb、Cytc和Cytc1)。结果:与青年组大鼠比较,老年组大鼠的肝组织细胞线粒体含理有一定下和,百3个氧化酶活性却显增加,同时细胞色素含量尤其是Cytb和Cytc显升高,941方组大鼠肝组织细胞线粒体上述指标皆显高于青年组和老年组。结论:衰老大鼠肝组织线粒体酶活性与青年组有显不同,表明衰老过程中肝细胞通过某种反馈机制使残存完好的线粒体氧功能代偿性增强;941方使这种作用进一步增强。 相似文献
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目的:获取多囊蛋白-1胞内区片段。方法:用PCR法克隆多囊蛋白-1胞内区的cDNA片段,然后插入融合蛋白表达载体pProEXHta中,经测序证实后,转入大肠杆菌中表达并用亲和层析法进行纯化。结果:克隆到一个660bp的多囊蛋白-1胞内区cDNA片段,得到了一个相对分子质量为2.6万的融合蛋白。结论:多囊蛋白-1胞内区片段的融合蛋白为制备抗多囊蛋白-1单克隆抗体提供了基础。 相似文献
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大鼠肝脏再生增强因子cDNA的克隆及其序列分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:克隆大鼠肝脏再生增强因子(ALR)cDNA,并对其序列进行分析。方法:建立大鼠2/3肝切除模型,从再生肝组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增出大鼠ALRcDNA,亚克隆于pGEM-T载体,并将DNA序列及其推测的氨基酸序列与Genebank作同源性比较。结果和结论:克隆到大鼠ALRcDNA,经核苷酸序列测定证实序列完全正确,其核苷酸序列没有任何突变,它与酵母ERV1cDNA有较高的同源性,核苷酸序列同源性达54.99%,氨基酸序列同源性达47.01%,并发现氨基酸序列中含有锌指蛋白结合区域。 相似文献
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大鼠肝再生过程中线粒体氧化磷酸化的调控 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:探讨肝部分切除后肝再生过程中线粒体能量代谢的调控。方法:用雄性Wistar大鼠施行肝部分切除复制肝再生模型,肝部分切除后分别观察05、1、2、4和7d5个肝再生组以及5个相应的对照组,差速离心法分离肝线粒体并用氧电极极谱法测定其氧化磷酸化活性。结果:肝部分切除后肝再生过程中线粒体呼吸控制率(RCR)明显高于相应对照组,其中肝部分切除后05d和4d为二个峰值,7d时降至对照组水平,早期RCR的升高主要是R3升高的所致,1d后RCR升高是R4下降所致。磷氧比值(P/O)的变化类似于RCR。结论:肝部分切除后肝再生过程中线粒体通过氧化磷酸化偶联增强来适应肝再生的能量需求,这种增强机制很可能主要是通过降低线粒体内膜通透性实现的。 相似文献
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衰老大鼠肝线粒体质与量的改变 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:探究大鼠衰老时肝组织细胞线粒体的变化规律。方法:分别从4月龄和24月龄大鼠的肝组织分离出线粒体,并用双缩脲法测定单位组织的线粒体蛋白;用Clark氧电极极谱法分别测定线粒体呼吸链3个氧化酶活性:NADH氧化酶、琥珀酸氧化酶和细胞色素氧化酶;用差光谱法(连二亚硫酸还原的消光值减去正铁氰化钾氧化的消光值)获得细胞色素a,b,c和c1(Cyta,b,c和c1)含量。结果:与4月龄大鼠相比,24月龄大鼠的肝组织细胞线粒体含量有一定的下降,而3个氧化酶活性显著增强,同时细胞色素含量尤其是Cytb和c1也显著升高。结论:衰老大鼠肝组织线粒体呼吸链氧化功能增强可能是通过某种反馈机制使残存尚好的线粒体代偿性功能增强。 相似文献
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重组人降钙素在大肠杆菌的表达和纯化 总被引:2,自引:0,他引:2
重组人降钙素在大肠杆菌的表达和纯化王官将毛积芳窦鸿蔡在龙邹鲁峰人降钙素(Humancalcitonin,hCT)是甲状腺滤泡旁细胞分泌的多肽激素,在体内参与钙、磷代谢的调节。临床上降钙素用于治疗各种疾病,如高血钙症、骨质疏松症和骨瘤病等,具有副作用小... 相似文献