饥饿大鼠胰岛胰高血糖素和嗜铬颗粒素A变化的定量免疫组织化学研究

用免疫组织化学ＡＢＣ法结合图像分析技术，研究饥饿状态下大鼠胰岛胰高血糖素（ｇｌｕｃａｇｏｎ，Ｇｌｕ）和嗜铬颗粒素Ａ（ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎＡ，ＣｇＡ）的含量变化。结果表明，与正常对照组相比，饥饿大鼠胰岛Ａ细胞中Ｇｌｕ含量明显下降，ＣｇＡ含量仅在饥饿５ｄ后显著下降。这提示饥饿可导致Ｇｌｕ释放快速增加，而ＣｇＡ释放增加却较为缓慢。与饥饿５ｄ大鼠组相比较，饥饿５ｄ后静脉注射葡萄糖（１ｇ／ｋｇ体重）９０ｍｉｎ后胰岛Ａ细胞内Ｇｌｕ含量明显升高，ＣｇＡ含量无显著变化。提示静脉注射葡萄糖可作用于胰岛Ａ细胞，使Ｇｌｕ释放快速减少，但对ＣｇＡ的释放无影响。以上结果表明，外源性葡萄糖对胰岛Ａ细胞中Ｇｌｕ和ＣｇＡ两种物质的作用机制不同，为进一步阐明胰岛内Ｇｌｕ和ＣｇＡ的不同生理作用提供了形态学依据。     

识别不同结构域的PTA1/CD226的mAb与活化血小板的关系

目的:研究识别不同PTA1/CD226分子结构域的mAb与刺激血小板活化的关系。方法:采用识别不同结构域的抗PTA1/CD226的mAb(FMU17),应用免疫荧光染色、流式细胞术和血小板凝集试验,研究识别不同结构域mAb对血小板的活化作用。结果:识别CD226第1个结构域的3株mAb(FMU1、2和3)可以与血小板结合,并可刺激血小板发生凝集,而识别CD226第2个结构域的mAbFMU6、FMU7以及识别两个结构域之间序列的FMU4和FMU5既不能与血小板表面天然的CD226分子结合,也不能刺激血小板活化。结论:抗PTA1/CD226mAb刺激血小板活化与抗体识别的结构域有关。     

树突状细胞负载肝癌抗原肽疫苗体外诱导特异性免疫学反应的研究

目的：研究树突状细胞(dendritic cell，DC)负载肝癌抗原肽EPVTKAEML体外诱导特异性CTL的能力及其抑癌效果。方法：用顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR—SSP)选择HLA—B7表型供者，从脾组织中分离、培养DC-EPVTKAEML特异性CTL。用^51Cr释放法检测CTL的杀伤活性，并用抗HLA-1分子单抗(mAb)进行杀伤抑制实验。结果：找到4例HLA-B7杂合子供者，用DC负载HLA-B7限制的抗原肽EPVTKAEML可诱导特异性CTL反应，对肝癌细胞HHCC有较强的杀伤作用。结论：DC负载抗原肽EPVTKAEML在体外可诱发较强的特异性免疫反应。     

趋化性细胞因子对人Tc1和Tc2细胞内Ca~(2+)浓度变化的影响

为了探讨趋化性细胞因子在体外对人Tc1和Tc2亚群细胞内Ca2 + 浓度变化的影响 ,从PBMC中分离纯化CD8+ T细胞 ,在特定细胞因子及细胞因子抗体作用下 ,体外定向诱导出能长期培养的Tc1和Tc2细胞系 ,用免疫荧光染色结合流式细胞术分析对其进行鉴定后 ,通过流式细胞术检测在趋化性细胞因子刺激前后 ,细胞内Ca2 + 浓度的变化。发现受SDF 1作用后 ,Tc1及Tc2细胞内Ca2 + 浓度变化均不明显 ,而IP 10刺激后 ,Tc1及Tc2细胞内Ca2 + 水平在短时间内明显上调 ,且在Tc1胞内的上升幅度远高于Tc2细胞 ,在MIP 1β刺激后 ,也观察到类似趋势 ;受Eotaxin刺激后 ,Tc1及Tc2细胞内Ca2 + 水平均有微小上升 ,在Tc2细胞内的上升幅度略高于Tc1细胞。说明Tc1和Tc2细胞受趋化性细胞因子作用后 ,细胞内Ca2 + 浓度有不同程度的变化 ,且与趋化性细胞因子受体的表达呈现一定的相关性。     

趋化性细胞因子受体在Tc1和Tc2亚群的差异表达

目的研究趋化性细胞因子受体在体外长期培养的人Te1和Tc2细胞系中的表达。方法将新鲜分离的PBMC在特定细胞因子及细胞因子抗体存在条件下，定向诱导为Ⅰ型和Ⅱ型T细胞系，用免疫荧光染色结合流式细胞术分析鉴定，并以膜表面及胞内三色流式细胞术检测趋化性细胞因子受体在不同T细胞亚群的表达。结果①在Ⅰ型和Ⅱ型T细胞整体水平上，CXCR4的表达水平接近，CXCR3和CCR5的表达在Ⅰ型T细胞明显高于Ⅱ型T细胞，CCR3在2种T细胞系的表达水平均较低，但在Ⅱ型T细胞的表达略高于Ⅰ型T细胞；②趋化性细胞因子受体在Tc1和Tc2亚群细胞的表达与上述结果类似，即CXCR的表达水平接近，CXCR3和CCR5的表达在Tc1高于Tc2，CCR3的表达水平较低，但在Tc2则略高于Tc1。结论趋化性细胞因子受体在Tc1和Tc2亚群的表达具有差异性。     

流式细胞术外周血样品间标的方法

目的　建立一种新的用于流式细胞术 (FCM)外周血样品的间标荧光染色方法 .方法　抗凝全血 1 0 0 μL,加入一抗 5 0μL ,室温下反应 30 min,上 Q- PREP型免疫学样品制备仪 ,溶解红细胞和固定标品 ,加入荧光二抗 5 0 μL ,室温下反应 30 min,再加入 5 0 0 μL 的 PBS制成单细胞悬液 ,上流式细胞仪分析 ,同时与其他 5种常规方法进行比较 .结果　本方法与其他 5种方法的 FCM测定结果基本一致 (P>0 .0 5 ) ,而本方法样品用量少 ,操作简单 ,快速、染色时间仅需 70 m in.结论　我们建立的外周血样品间接荧光染色法 (方法 2 ) ,是外周血 FCM样品染色的理想方法 ,该方法对于 FCM在临床检验和基础研究的应用提供了技术支持 ,具有较强的实用价值 .     

采用罗丹明123对肝癌细胞系MHCC97(Rholow)干细胞亚群的分离及鉴定

目的 建立分离肝癌细胞系MHCC97细胞中对罗丹明123染料具有不同排斥能力细胞亚群的方法,并探讨其在肝癌干细胞和异质性研究中的意义.方法 利用流式细胞分选术(FCM)并结合不同浓度的罗丹明123(Rho123)染料,分析和分选肝癌细胞系MHCC97细胞中具有不同染料排斥能力的肝癌细胞亚群,再通过细胞生长的测定、软琼脂克隆形成以及免疫组织化学检测和裸鼠成瘤实验等方法,以比较不同肝癌细胞亚群的差异.结果 根据不同染料排斥能力可以将肝癌细胞系MHCC97细胞分为Rholow和Rhohigh2个亚群,2个亚群在增殖能力、克隆形成率以及甲胎蛋白(AFP)和角蛋白-19(CK-19)表达以及裸鼠成瘤实验上差异有统计学意义,Rholow亚群具有干细胞特性.结论 罗丹明123结合FCM可以富集具有干细胞特性的Rholow亚群,同时为进一步揭示肝癌异质性机制奠定基础.     

Cyclin D1在胶质瘤细胞系中表达分布模式的初步研究

目的：探讨cyclin D1在胶质瘤细胞系中的细胞周期表达模式，将为从生物学功能上阐明cyclin D1在胶质瘤细胞周期演进中的作用．方法：利用流式细胞仪双参数法和细胞同步化，确定cyclin D1在胶质瘤细胞系SHG-44和BT-325中的细胞周期表达分布模式．结果：在胶质瘤细胞系SHG-44和BT-325中，Cyclin Dl的表达呈细胞周期依赖性：在SHG-44中，cyclin D1在G1期表达最高，4h左右达到峰值，S期及G2／M期下降，但仍可检测到；在BT-325中，cyclin D1在G1期表达最高，6h左右达到峰值，S期及G2／M期下降，但仍可检测到．结论：cyclin D1蛋白质的表达呈细胞周期依赖性，且与细胞周期行进有关；cyclin D1在SHG-44和BT-325胶质瘤细胞进入G1期的早期发挥着重要的生物学作用。     

拓扑异构酶Ⅰ抑制剂对K562细胞的杀伤与诱导凋亡作用

背景与目的:近年发现,拓扑异构酶Ⅰ抑制剂对加速期或急变期的慢性髓细胞白血病有较好疗效.为了深入理解拓扑异构酶Ⅰ抑制剂这一新的药理作用,本研究采用具有慢性髓细胞白血病特征性异常染色体[t(9;22)]的K562细胞株为实验对象,进一步探讨拓扑异构酶Ⅰ抑制剂拓扑替康(topotecan)对靶细胞的杀伤与诱导凋亡活性.方法:采用MTT法测定拓扑替康对K562细胞的杀伤作用;通过形态学与AnnexinVFITC染色,研究拓扑替康对靶细胞的促凋亡活性;采用caspase 8特异性抑制剂IETD fmk,分析拓扑替康介导的细胞杀伤或凋亡和caspase活化的关系.结果:经0 15μmol/L拓扑替康处理至12、24、48及72h时,K562细胞的存活率与对照相比,逐渐降至(92±36)%[P>0 05vs(94±27)%]、(68±21)%[P<0 05vs(119±13)%]、(54±15)%[P<0 05vs(132±31)%]及(21±10)%[P<0 01vs(114±19)%];同时,靶细胞出现磷脂酰丝氨酸外翻、细胞固缩、染色质边集、核碎裂,最终解离为大量凋亡小体;经caspase 8抑制剂与拓扑替康联合处理至24、48h时,K562细胞的存活率依然维持在(95±29)%与(87±11)%,后者显著高于单用拓扑替康者[P<0 05vs(54±15)%],且无明确的凋亡小体形成.结论:拓扑异构酶Ⅰ抑制剂拓扑替康对K562细胞具有较强的杀伤活性与诱导凋亡作用,该过程可能依赖caspase 8的活化.     

p21^WAF1基因介导诱发的人肝癌细胞系的细胞凋亡研究

目的研究外源性ｐ２１ＷＡＦ１基因超表达对ＨＣＣ－９２０４肝癌细胞系的作用和意义。方法通过脂质体介导方式将带有人全长ｐ２１ＷＡＦ１ｃＤＮＡ和潮霉素抗性基因的真核表达载体ＰＣＥＰ转入肝癌细胞中，用潮霉素筛选后，酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）法检测ｐ２１蛋白的表达情况，使用流式细胞仪检测细胞周期并判定有无细胞凋亡及程度。通过透射电镜进一步观察细胞的超微结构。结果ＥＬＩＳＡ法测定ｐ２１蛋白表达结果，对照组、空载体组和ＷＡＦ１组的吸光度（Ａ）值分别为０．１７５±０．０２、０．１８３±０．０３和０．３３±０．０４，提示转基因后ｐ２１蛋白量却明显增加（Ｐ＜０．０５）。流式细胞仪检测细胞周期表明Ｇ１期细胞显著增加，并在Ｇ１期前出现一凋亡峰，凋亡细胞占细胞总数的２２．５％。透射电镜可见ＷＡＦ１组部分细胞体积缩小，细胞完整，有出芽现象，细胞器结构完整，致密的染色体边集于核膜内侧，呈明显的凋亡细胞的形态。结论本实验成功地将ｐ２１ＷＡＦ１基因转入到培养的肝细胞中，获得了稳定表达ｐ２１蛋白的细胞株；外源性ｐ２１ＷＡＦ１基因的超表达可引起肝癌细胞自发凋亡。通过对该基因的进一步研究可为肝癌防治提供理论依据。