广州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子分型及耐药性分析

目的 了解广州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)分子型别及其对临床常用抗生素的耐药情况,为防控MRSA感染提供依据.方法 收集2010年10月至2011年4月广州地区两家教学医院临床分离的MRSA 142株,应用SCCmec、spa、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)等方法进行分子分型,检测这些菌株对苯唑西林、克林霉素等17种临床常用抗生素的药物敏感性,分析临床MRSA的耐药情况.结果 142株MRSA中121株为医院获得型金葡菌(HA-MRSA),20株为社区获得型金葡菌(CA-MRSA),1株未定型MRSA.这些MRSA可分为16种spa型,8种ST型及13种PFGE型.HA-MR-SA中的ST239-MRSA-Ⅲ-t030、ST239-MRSA-Ⅲ-t037和ST5-MRSA-Ⅱ-t002为主要流行克隆,也发现CA-MRSA中ST59-MR-SA-Ⅳ-t437克隆的流行,且这些流行克隆有特定的耐药谱.结论 广州地区流行的金葡菌仍以HA-MRSA为主,同时也有一定量的CA-MRSA检出和传播,且CA-MRSA的多重药物敏感性已在下降.     

登革病毒样颗粒研究概况

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是不含病毒特异核酸的空壳结构,许多病毒结构蛋白都具有自动组装成VLPs的能力,在形态结构上与天然的病毒颗粒相似,具有很强的免疫原性和生物学活性。登革病毒(Dengue virus,DV)为黄病毒属的一员,伊蚊为其传播媒介,流行地域广泛,影响人口众多,所致疾病复杂,发病率高,目前尚缺乏有效的治疗手段和预防措施。文中对DV的组装与成熟,VLPs的产生、影响DV的VLPs产生因素,以及在研制疫苗或佐剂等方面的应用前景做一综述。     

乌鲁木齐地区金黄色葡萄球菌分离株的分子分型与耐药性分析

目的 了解乌鲁木齐地区金黄色葡萄球菌临床分离株的分子特征及其对临床常用抗生素的耐药情况.方法 收集2010年6月至2012年12月期间乌鲁木齐地区一所大型综合医院临床分离的86株金黄色葡萄球菌,在鉴定区分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA)的基础上,应用SCCmec分型、spa分型、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、脉冲场凝胶电泳分型(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)、agr分型等葡萄球菌分子分型方法进行分析,检测pvl毒力基因的携带率,检测菌株对苯唑西林、红霉素、四环素等13种临床常用抗生素的耐药性,分析菌株的耐药情况及耐药基因.结果 86株金葡菌中31株为MRSA,55株为MSSA.31株MRSA分为8种spa型和7种ST型,优势流行克隆为ST239-MRSA-Ⅲ-t030 (71％,22/31).55株MSSA分为23种spa型、16种ST型和8个PFGE聚类组,agrⅠ型占56.4％ (31/55).MSSA菌株的pvl毒力基因检出率为49.1％ (27/55),MRSA为38.7％(12/31).药敏结果显示31株MRSA均为多重耐药(multidrug-resistant,MDR)菌株,55株MSSA中有31株为MDR菌株.结论 乌鲁木齐地区流行的MRSA以ST239-MRSA-Ⅲ-t030为主,而MSSA表现出较高遗传多样性,发现有t11413,ST121等新的型别流行.     

登革1型病毒GZ2002株全基因组测序与分析

目的对2002年分离自广州登革热患者的1型登革病毒GZ2002株进行全基因组序列测定及分析,为探讨其来源和基因组特征提供依据。方法利用C6/36细胞增殖GZ2002株,出现典型细胞病变后收集感染细胞及病毒液提取R NA。根据5株登革病毒1型标准株AY145123、FJ176780、FJ176779、DVU88536、EF025110全序列设计6对相互覆盖的引物。采用R T-PCR法扩增覆盖GZ2002株基因组全长的6个cDNA片段,并将其分别克隆到pMD-18T载体上,通过序列测定和重叠序列拼接获得全基因组序列。结果 GZ2002株基因组全长10 735 nt,单一阅读框长10 176 nt,推测编码3 392个氨基酸,5’及3’-UTR分别为94 nt和462 nt,无显著的密码子偏嗜性。GenBank登录号:JN205310。系统进化分析显示GZ2002株属于DENV-1型基因IV型。比较不同致病性的DENV-1型毒株发现,随DENV毒株致病力的增强,编码区氨基酸突变位点明显增多。GZ2002株、泰国16007株、柬埔寨株及印度尼西亚98901530株的5’-UTR二级结构高度保守,3’-UTR分析显示强毒力泰国16007株与柬埔寨株均存在高突变区。结论 GZ2002株属于DENV-1型基因IV型,可能与1998年印度尼西亚DENV-1流行株相关,编码区株特有氨基酸变异位点及3’-UTR高突变区的生物学意义值得进一步探讨。     

登革-日本脑炎嵌合病毒样颗粒的设计与构建

目的设计构建登革-日本脑炎嵌合蛋白表达载体,制备嵌合病毒样颗粒。方法 根据登革病毒样颗粒的形成机制及日本脑炎病毒中和性抗原表位的分布,设计并构建登革-日本脑炎嵌合蛋白表达载体,转染BHK-21细胞,筛选能表达目标蛋白的G418抗性克隆,收集细胞培养上清,纯化病毒样颗粒,用Western-blot和电镜检测病毒样颗粒的形成。结果用RT-PCR扩增、酶切和连接等分子生物学方法成功构建了序列及阅读框均正确的重组表达质粒pCI-SMEJ-14#;将该质粒转染BHK-21细胞,经0.6 g/LG418筛选获得4个能表达目标嵌合蛋白的克隆,从培养的细胞上清中能纯化出直径30~100 nm的病毒样颗粒。结论 所设计的登革-日本脑炎病毒嵌合蛋白能在BHK-21细胞中产生病毒样颗粒,为制备新一代登革-日本脑炎嵌合型疫苗奠定了良好基础。     

重复序列致agrC突变对金黄色葡萄球菌致病性的影响

目的 探讨金黄色葡萄球菌XQ株毒力变异的机制.方法 以金黄色葡萄球菌ATCC25923为对照,采用动物实验观察临床分离的金葡菌XQ株在体外传代后的毒力改变;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析菌体及培养上清的蛋白谱变化,应用PCR进行金葡菌附属调节基因agr扩增并测序,分析菌株毒力变异的机制,并进一步通过qRT-PCR检测XQ株agr调控的毒力因子变化情况.结果 动物毒力实验证实XQ株的毒力较对照菌ATCC25923强,体外传代培养后,XQ株第180代菌株(XQ1s0)的毒力明显下降,SDS-PAGE分析发现毒力下降的XQ株(XQM株)培养上清的蛋白表达谱较XQ株有明显改变,对金葡菌agr基因进行测序分析发现XQM株的agrC基因第443位有一段188 bp的序列插入,而该插入序列就是agrC基因255～442间序列,正是该188 bp重复序列导致AgrC蛋白的截短型突变,引起新桥株的致病性降低,qRT-PCR检测结果证实XQM株中受agr调控的毒力基因表达水平显著下降.结论 临床分离的金葡菌XQ株毒力强,在体外传代中易发生毒力变异,这种变异与重复序列导致的agrC突变有关.     

SigB (Q225P)突变促进金黄色葡萄球菌生物被膜形成

目的 探讨金黄色葡萄球菌SigB(Q225P)突变对其生物被膜形成能力的影响.方法 比较临床分离金葡菌(XQ株)与实验室传代获得菌落颜色变白之XQW株的生物学特性,通过结晶紫染色法以及激光共聚焦检测菌株的生物被膜形成.进行XQ及XQW全基因组测序,比较相关基因,寻找突变位点.分别扩增sigB(Q225P)基因及其上游片段,经酶切后连接穿梭载体pBT2,构建同源重组质粒pBT2-sigB(Q225P),电转化至金葡菌RN4220,再将经RN4220修饰后的质粒电转入Newman.利用pBT2质粒对温度敏感的特点筛选Newman-sigB(Q225P).利用同样的方法构建sigB敲除菌株Newman-△sigB,并构建回补菌株Newman-△sigB/sigB以及Newman-△sigB/sigB(Q225P).比较这些菌株的生物被膜形成差异.结果 XQW株在液体培养基中呈絮状生长,结晶紫法以及激光共聚焦检测结果显示其生物被膜形成能力显著强于野生株,全基因组测序和比较发现XQW的sigB基因发生(Q225P)突变.构建的同源重组质粒pBT2-sigB(Q225P)及pBT2-△sigB转化金葡菌Newman后,经筛选,获得Newman-sigB(Q225P)及Newman-△sigB菌株;回补质粒pLI50-sigB及pLI50-sigB (Q225P)转化Newman-△sigB,筛选获得回补菌株Newman-△sigB/sigB及Newman-△sigB/sigB(Q225 P).经过结晶紫染色法及激光共聚焦测定生物被膜,发现Newman-sigB(Q225P)较野生株的生物被膜形成能力显著升高,与XQW的生物被膜形成能力强于XQ野生型的表型相一致;Newman-△sigB/sigB(Q225P)的生物被膜形成能力明显高于Newman-△sigB/sigB.结论 SigB (Q225P)具有促进金葡菌生物被膜形成的能力.     

登革病毒感染人原代树突状细胞(CD209,-139A/-336A)模型的建立

目的 建立以人原代树突状细胞(dendritic cells,DCs)为宿主的登革病毒(dengue virus,DENV)感染模型.方法 采集基因型为CD209,-139A/-336A的人抗凝血标本,分离获得DCs前体细胞,利用rhGM-CSF及rhIL-4诱导,获得未成熟DCs.瑞氏染色鉴定DCs的形态,流式细胞术鉴定DCs的分化效率,淋巴细胞增殖实验鉴定DCs的生物学功能.以Ⅰ型登革病毒GZ2002株为模式病毒进行病毒感染实验,建立并评估以人原代DCs为宿主的登革病毒感染模型.结果 分离获得的DCs前体细胞经细胞因子刺激后成功分化为未成熟DCs,分化效率高达90％.获得的DCs具有典型的细胞形态及生物学功能,可有效刺激淋巴细胞增殖.登革病毒GZ2002株能成功感染诱导获得的原代DCs,促进DCs成熟,并复制产生感染性子代病毒,证明细胞感染模型成功建立.结论 成功建立以DCs为宿主的登革病毒感染模型.