携带靶向沉默LSD1基因表达shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建慢病毒干扰LSD1表达的载体并鉴定。方法:设计并合成3对针对LSD1基因的shRNA链,退火形成双链,与酶切的质粒连接,转化DH5a菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。脂质体法转染人胃癌MKN-28细胞,通过荧光倒置显微镜判定转染效率,并通过real time-PCR法检测细胞中LSD1基因的表达水平。结果:经酶切鉴定筛选出的重组质粒测序结果与目的序列相同,重组质粒构建成功;转染胃癌MKN-28细胞后,LSD1基因在mRNA水平的表达降低。结论:成功构建了靶向LSD1基因的shRNA慢病毒载体,并筛选出1种对LSD1基因有显著抑制作用的shRNA。     

结直肠侧向发育型肿瘤癌变的内镜学特征

目的 探讨结直肠侧向发育型肿瘤（laterally spreading tumor,LST）癌变的独立预测因素。方法 回顾性收集于2013年6月—2019年3月在首都医科大学附属北京友谊医院因结直肠LST行内镜治疗患者的性别、年龄、体重指数、吸烟史、病变的内镜学特征和病理学特点。用单因素分析寻找癌变的影响因素,对于其中差异有统计学意义的因素再纳入多因素Logistic回归分析。结果 共纳入了323例患者341处病变。假凹陷型LST的癌变率最高[85.48%（53/62）],其次为结节混合型[76.97%（117/152）],均显著高于颗粒均一型[29.51%（18/61）,P均＜0.001]和扁平隆起型[24.24%（16/66）,P均＜0.001]。单因素分析显示,假凹陷型（P＜0.001,OR=18.40,95%CI：7.46～45.42）、结节混合型（P＜0.001,OR=10.45,95%CI：5.30～20.58）、位于直乙部位（P＜0.001,OR=2.33,95%CI：1.47～3.69）、直径≥2 cm（P＜0.001,OR=2.60,95%CI：1.60～4.00）是病变发生癌变的危险因素。多因素Logistic回归分析表明,假凹陷型（P＜0.001,OR=17.51,95%CI：7.06～43.43）、结节混合型（P＜0.001,OR=8.25,95%CI：4.07～16.73）、直径≥2 cm（P=0.032,OR=1.80,95%CI：1.05～3.08）是结直肠LST发生癌变的独立预测因素。结论 当LST为假凹陷型、结节混合型或直径≥2 cm时病变发生癌变的风险高,需要采取整块切除的方式治疗。     

热休克蛋白70诱导抗肿瘤免疫的机制研究

目的　研究肿瘤热休克蛋白 70 (HSP70 )诱导的抗肿瘤免疫产生的机制。方法　用液相色谱法提纯小鼠肿瘤细胞株中的HSP70。通过动物实验观察HSP70的抗肿瘤作用 ,并用流式细胞技术测定HSP70免疫后小鼠外周血中T细胞亚群的变化。用ELISA法测定HSP70免疫后小鼠体内细胞因子的水平。结果　用HSP70免疫后 ,小鼠外周血中CD8+T细胞及几种主要Th1型细胞因子 (IL 2、TNF α、TNF β和IFN γ)均升高 ,与对照组相比较 ,差异显著 (P <0 .0 1)。结论　HSP70免疫后 ,小鼠外周血中CD8+ T细胞及Th1型细胞因子均有明显升高。此作用可能是其诱导特异性抗肿瘤免疫的重要机制     

Wnt/β-catenin信号通路中Wnt基因对肾癌细胞的生物学影响

目的探讨Wnt基因对肾透明细胞癌Caki-2细胞的生物学影响。方法细胞分3组:Caki-2组(空白对照)、shRNA+Wnt+Caki-2组(慢病毒沉默Caki-2细胞中的Wnt基因)、空载体组(实验对照),CCK-8法观察不同时间各组细胞的增殖情况;透射电镜观察沉默Wnt基因对Caki-2细胞凋亡的影响;Transwell小室方法检测各组细胞侵袭能力的变化;实时PCR观察Wnt/β-catenin信号通路中下游基因的变化和凋亡相关基因的变化。结果 shRNA+Wnt+Caki-2组出现了细胞增殖抑制,其增殖能力与其他2组相比差异有统计学意义(P<0.05)。sh RNA+Wnt+Caki-2组表现出明显的细胞凋亡变化,出现凋亡小体。侵袭实验显示,shRNA+Wnt+Caki-2组迁出的细胞数明显低于其他2组(P<0.05);shRNA+Wnt+Caki-2组中Wnt mRNA、β-catenin mRNA和Bcl-2 mRNA的表达水平均低于其他2组(P<0.05)。结论慢病毒沉默Wnt基因,影响了肾透明细胞癌Caki-2细胞的增殖,促进了细胞的凋亡,抑制了Caki-2细胞的侵袭。     

评价64排螺旋CT三维重建技术评估稳定性骨盆骨折的应用价值

目的:评价64排螺旋CT三维重建技术评估稳定性骨盆骨折的应用价值。方法:回顾性分析我院2015年6月-2019年6月收治的20例骨盆骨折患者的临床资料,结合手术结果,对64排螺旋CT三维重建及X线两种影像学检查方式对各个部位骨折诊断准确率进行观察和比较。结果:在不同部位骨折检查中,64排螺旋CT三维重建诊断准确率皆比X线检查高(P<0.05),且骨折总诊断准确率明显比X线检查高(P<0.05)。结论:在骨盆骨折诊断方式中,CT检查有效率较高,而对64排螺旋CT三维重建技术加以应用,可使盆骨骨折诊断准确率得到进一步提高。     

腹腔内温热免疫化疗对胃及结直肠癌腹腔内复发的防治作用

目的评价腹腔内温热化疗合并白细胞介素-2(IL-2)免疫治疗对胃及结直肠癌术后腹腔内复发的治疗或预防作用。方法将1996年1月至1998年6月以来手术切除的35例T3Ⅱ～T4ⅢB期胃癌及111例B～D期的结直肠癌患者随机分成温热化疗组及联合免疫治疗组。温热化疗在手术后全麻下进行1h,化疗药为氟尿嘧啶(5-FU)0.5g/L,丝裂霉素(MMC)8mg/L,术后第3d行IL-2腹腔内免疫治疗。将IL-2100万U加入1000ml生理盐水中滴入腹腔,隔日进行,共10次,于免疫治疗的前后应用ELISA法测定两组患者外周血中几种主要Th1型细胞因子的水平,随访比较两组患者的生存率、腹腔内复发率及肝转移发生率,进行统计学分析。结果与温热化疗组相比,联合免疫治疗组的几种主要Th1型细胞因子的水平均明显升高,差异有非常显著性意义(P<0.01);3年生存率升高13.2%,而腹腔内转移率和肝转移发生率分别下降13.5%和6.2%,差异均有显著性意义(P<0.05～P<0.01)。结论腹腔内温热化疗合并免疫治疗可促进Th1型免疫漂移,增强机体的抗肿瘤免疫功能,对预防和治疗胃及结直肠癌腹腔内复发与肝转移有一定的作用。     

CUL4A促进人胃癌细胞增殖、侵袭和转移的机制

目的:探讨CUL4A基因在胃癌增殖、侵袭和转移中的机制。方法:siRNA干扰胃癌SCG-7901细胞中CUL4A基因的表达;CCK-8法检测各组细胞的增殖情况;Transwell小室观察各组细胞的侵袭能力;Annexin-V-FITC/PI法检测各组细胞的凋亡情况,分析CUL4A对细胞凋亡的影响;Real time-PCR分析上皮间质转化（EMT）相关基因的表达情况。结果:siRNA有效干扰了胃癌SCG-7901细胞中CUL4A基因的表达（P＜0.05）;干扰CUL4A基因有效抑制了胃癌细胞的增殖（P＜0.05）;Transwell小室结果显示,干扰CUL4A基因阻碍了SCG-7901细胞的侵袭能力（P＜0.05）;细胞凋亡结果显示,干扰CUL4A基因促进了细胞的凋亡（P＜0.05）;Real time-PCR结果显示,干扰CUL4A基因后Snail mRNA和ZEB1 mRNA的表达降低（P＜0.05）,E-cadherin mRNA的表达升高（P＜0.05）。结论:CUL4A基因促进胃癌细胞的增殖,抑制凋亡和侵袭,且影响了EMT相关基因的表达。     

肿瘤热休克蛋白70对荷瘤鼠Th1型细胞因子表达的影响

目的：研究应用肿瘤来源的热休克蛋白70治疗后荷瘤小鼠外因中几种Th1型细胞因子水平的动态变化，探讨其打破荷瘤机体的免疫耐受、诱导抗肿瘤免疫的机制，为其应用于治疗人类的恶性肿瘤提供有价值的参考依据。方法：细胞培养、蛋白质纯化技术、电泳技术、Western-blot法、毛细管电泳、动物实验、ELISA等。结果：肿瘤来源的热休克蛋白70具有明显的抑瘤作用，并且能够诱升荷瘤小鼠外周血中几种主要的Th1型细胞因子（IL－2，TNF－β，IFN－γ）的水平，随HSP70的应用频次增加而逐渐升高，在最后治疗的2周后仍未见下降趋势，与对照组相比，差异显著（P＜0．01）。结论：肿瘤来源的HSP70对荷交谈小鼠Th1型细胞因子有明确的诱升作用，进而诱导机体产生并维持有效的抗肿瘤免疫效应，该作用是其抗肿瘤免疫效应的一个重要方面。     

双抗体夹心ELISA定量检测血清Cap43蛋白方法的建立与评价

目的建立定量检测血清Cap43蛋白表达双抗体夹心ELISA法。并初步探讨血清Cap43蛋白表达水平在肺癌患者与正常人群间有无差异，以及该蛋白表达水平的高低与肺癌组织学分型间的关系。方法建立双抗体夹心ELISA方法对肺癌患者与正常人群血清中Cap43蛋白的含量进行定量检测。结果双抗夹心ELISA包被Ⅰ抗羊抗人NDRGl多克隆抗体（PcAb）、Ⅰ抗兔抗人Cap43PcAb以及辣根酶（HRP）标记的羊抗兔Ⅱ抗的最佳工作浓度分别为1：750，1：1200，1：350，标准蛋白曲线的回归方程为：y=0．53566＋0．00046x，R2=0．9939，P〈0．0001。应用该方法初步检测结果显示：肺癌组血清标本Cap43蛋白含量明显高于正常对照组（P〈0．01），且肺腺癌组病人血清Cap43含量高于肺鳞癌组（P〈0．01）。该方法的敏感度（SE）为84．51％，特异度（SP）为35．00％。结论建立了一种敏感度高，重复性好的定量检测血清中Cap43蛋白的双抗体夹心ELISA方法；Cap43蛋白在肺癌患者血清中呈现高表达，且在肺腺癌组病人血清中表达水平高于肺鳞癌组。     

兔抗Cap43多克隆抗体制备和初步纯化

目的制备兔抗Cap43多克隆抗体。方法以30个氨基酸组成的多肽为半抗原与钥孔血蓝蛋白（mcKLH）通过碳化二亚胺（EDC）法化学偶联成完全抗原（多肽-mcKLH）免疫家兔；制备兔抗Cap4443多克隆抗体；斑点ELISA法检测抗体效价，经辛酸一硫酸铵法初步纯化抗体后，十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳考马斯亮蓝检测其纯化后的纯度。结果经免疫11周得到兔抗Cap43多克隆体，抗体效价为1：500。结论采用EDC化学偶联半抗原和大分子载体蛋白mcKLH，使其成为同时具有免疫原性与免疫反应性的完全抗原，用其免疫家兔获得多克隆抗体。