胶原蛋白-明胶支架材料修复大鼠坐骨神经缺损的研究

目的制备胶原蛋白一明胶神经支架材料（CG材料）并研究其在修复大鼠10mm坐骨神经缺损实验中的疗效。方法以I型胶原蛋白、明胶通过冷冻干燥技术制备具有轴向微管结构的神经支架材料，用其桥接修复sD大鼠坐骨神经10mm缺损。术后16周分别行透射电镜，S-100、β-tubulin class Ⅲ、NFl60免疫荧光染色以及电生理检测，观察支架材料引导神经再生的疗效。结果制备的材料内部为孔径均匀且平行排列的微管结构，术后16周通过透射电镜和免疫荧光染色可见大量再生神经纤维，电生理检测神经传导速度及波幅接近自体神经移植。结论胶原蛋白一明胶支架材料能够有效的促进周围神经再生。     

一种可控性脊髓爆震伤模型的建立

目的建立实验室条件下的脊髓爆震伤模型,探讨脊髓爆震伤的致伤特点。方法采用单质锰炸药黑索金(RDX)纸壳雷管为爆源,随机取12只家兔,按爆距2、4、8 cm分为3组致伤,同时检测冲击波压强、正压作用时间。另将12只家兔随机分为致伤组和对照组,致伤组家兔按已选定的标准爆距致伤,观察伤后组织学变化。结果爆距2、4、8 cm测得冲击波压强分别为93.4、50.4、33.5 MPa,爆距4 cm时可造成双后肢运动诱发电位(MEP)潜伏期延长1.0 ms或波幅下降50%,而不致家兔死亡。病理学显示脊髓脊髓前角神经元出现明显坏死,髓鞘板层结构紊乱。结论本方法建立的可控性脊髓爆震伤模型简单、安全、有效,适用于实验室条件下的爆震伤研究。     

人胚肋软骨静止区细胞的体外培养及生物学特性研究

目的：研究体外培养的人胚肋软骨静止区细胞的生物学特性及分化规律，为组织工程生长板的研究提供种子细胞。方法：采用Ⅱ型胶原酶消化的方法获取人胚肋软骨静止区细胞．观察细胞形态学变化；测定细胞生长曲线；借助特殊染色、免疫荧光染色的方法了解糖胺聚糖、碱性磷酸酶、Ⅱ型胶原酶的合成情况。结果：贴壁后细胞呈多角形，从第6代开始绝大多数细胞转变为成纤维细胞状，细胞培养至第2代开始分泌大量Ⅱ型胶原。结论：体外单层培养的人胚肋软骨静止区细胞具有正常的生长增殖与分化能力，可分化至成熟期软骨细胞。     

自体组织工程生长板治疗长骨生长板损伤的实验研究

目的 探讨自体组织工程生长板在治疗生长板损伤中的作用。方法 自3周龄兔骼嵴处切取部分骼骨生长板软骨经机械剪切和Ⅱ型胶原酶消化后培养生长板软骨细胞,体外扩增后接种到同种异体脱钙骨基质(DHM)上,混合培养一周后,植入兔自体右侧胫骨上端内侧生长板缺损处(A组),分别设单纯DBM植入(B组)及单纯破坏即生长板破坏后无任何植入物(C组)作为对照组,左侧胫骨不作处理。术后动态X线摄片测量下肢短缩及成角畸形改变,通过组织切片HE染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色观察自体组织工程生长板在体内的转归。结果 术后第2周三组右侧胫骨均出现轻度畸形,A、B组较C组为轻,但三者之间无显著差异(P>0.05),此后B、C组兔右侧胫骨出现渐进性严重短缩及成角畸形,而A组右侧胫骨畸形则无明显加重,各时间点A组胫骨成角及缩短畸形与B、C组有显著差异(P<0.05),术后第16周时组织切片显示,A组损伤区基本恢复正常生长板结构,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,而B、C组损伤区则由新生骨组织修复。结论 自体组织工程生长板植入可有效防止急性生长板损伤后肢体畸形的发生,植入的组织工程生长板可产生柱状排列的结构,细胞可表达Ⅱ型胶原。     

藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞

目的观察胎儿关节软骨细胞在藻酸钙微载体培养中的特征,探讨用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞的优缺点。方法用藻酸钙微载体和体外单层培养法培养胎儿关节软骨细胞,观察细胞形态学变化,测定细胞数量变化及其生长曲线,观察细胞增殖;借助免疫组织化学的方法了解细胞II型胶原的合成情况。结果体外单层培养的胎儿关节软骨细胞传至第5代已出现明显的反分化,多数细胞变为成纤维细胞状,合成II型胶原的能力明显减弱;而用藻酸钙微载体培养的软骨细胞3个月后仍保持有旺盛的合成Ⅱ型胶原的能力。结论用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞可较长时间保持其表型及合成基质能力,防止反分化的发生。     

人胚肋软骨静止区细胞的体外培养及生物学特性研究

目的:研究体外培养的人胚肋软骨静止区细胞的生物学特性及分化规律,为组织工程生长板的研究提供种子细胞.方法:采用Ⅱ型胶原酶消化的方法获取人胚肋软骨静止区细胞,观察细胞形态学变化;测定细胞生长曲线;借助特殊染色、免疫荧光染色的方法了解糖胺聚糖、碱性磷酸酶、Ⅱ型胶原酶的合成情况.结果:贴壁后细胞呈多角形,从第6代开始绝大多数细胞转变为成纤维细胞状,细胞培养至第2代开始分泌大量Ⅱ型胶原.结论:体外单层培养的人胚肋软骨静止区细胞具有正常的生长增殖与分化能力,可分化至成熟期软骨细胞.     

兔髂骨生长板细胞的培养及体内成软骨作用的研究

目的 建立大量生产髂骨生长板软骨细胞的培养及保存方法,观察髂骨生长板细胞在裸鼠体内的成软骨作用,为生长板组织工程提供种子细胞。方法 取二周龄兔髂骨生长板软骨,经机械剪切和化学消化作用后,接种、培养及液氮保存,通过显微镜观察其生物学表现,并通过甲苯胺兰、碱性磷酸酶染色及Ⅱ型胶原染色对其生物学特性进行签定。将生长良好的第二代细胞注入裸鼠背部,于第四周取材,进行组织学观察。结果 细胞可在体外大量增殖并在六代内无明显反分化,但缺乏向肥大细胞进一步分化的能力。冷冻复苏细胞存活率为92％。注射的细胞悬液可在裸鼠体内形成软骨组织,并进一步向肥大细胞转化。结论 成功建立了髂骨生长板细胞的培养及冻存方法,证明髂骨生长板细胞可在体内进一步形成软骨组织并向肥大期细胞转化。     

大鼠水下可控性脊髓爆震伤模型的建立

目的摸索爆炸冲击波导致脊髓损伤的超压范围,建立实验室条件下脊髓爆震伤模型,探讨脊髓爆震伤的致伤特点。方法采用10 g的单质锰炸药（RDX）为水下爆源,随机取18只大鼠,通过手术将脊髓暴露后,将大鼠固定于封水仓内,仅椎板切除段脊髓外露于冲击波作用之下,最后按照冲击波到达脊髓表面的超压峰值为10、5、3 MPa分为3组致伤,同时检测冲击波的正压作用时间。另将12只大鼠随机分为致伤组和对照组,致伤组大鼠按照已选定的冲击波超压强度下爆炸致伤,观察伤后全身及脊髓的病理学变化。结果水下爆炸距离0.3、0.8、1.5 m测得的冲击波超压峰值分别为10、5、3 MPa,冲击波超压峰值为3 MPa时可造成大鼠双后肢运动诱发电位（motor evoked potential,MEP）潜伏期延长1.0 ms或波幅下降50%,而不致大鼠死亡。病理学显示脊髓内可见大量散在的出血坏死灶。结论水下爆炸冲击波超压峰值为3 MPa时,能够建立大鼠开放式可控性脊髓爆震伤模型。     

大鼠胚胎脊髓神经干细胞的分离培养及其向神经细胞的诱导分化

目的 分离培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞（SNSCs），研究其体外增殖分化的特点，模拟大鼠胚胎时期脊髓发育的微环境诱导SNSCs向神经细胞定向分化。方法显微机械分离孕10～11d胚胎大鼠脊髓神经干细胞，无血清悬浮培养，以复合添加剂N4定向诱导分化，并拍照记录不同时期细胞分化的形态；用不同荧光剂进行细胞免疫荧光染色，并计算阳性细胞的平均分化比例。结果 显微机械分离SNSCs方法，所分离的SNSCs具有较高的增殖能力，经复合添加剂N4诱导可以分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞。结论采用显微机械分离SNSCs方法简单、效率高，N4添加剂可以高效诱导SNSCs分化为神经细胞，且分化的细胞中神经元比例高。     

体外分离培养Balb/c小鼠胚胎干细胞向神经细胞定向诱导分化

目的: 探讨体外分离培养、诱导胚胎干细胞(ESCs)分化为神经细胞的高效方法. 方法: 自孕3.5 d的Balb/c小鼠获得附植前的早期胚胎,机械剥离法去除胚胎的滋养层细胞获取内细胞团(ICM)分别在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上和明胶包被的培养板中培养获得类ESCs克隆. 进行碱性磷酸酶染色,SSEA-1细胞免疫化学鉴定及体内分化实验鉴定. 模拟体内神经系统发育过程采用序贯诱导方法定向诱导ESCs分化为神经细胞,进行分化后细胞的免疫细胞化学鉴定. 结果: 所分离得到的细胞碱性磷酸酶染色阳性,SSEA-1表达阳性,体内分化实验证实具有多向分化潜能. 符合ESCs的一般特性. 经过序贯诱导方法可以高效诱导ESCs分化为神经细胞. 结论: 体外分离得到的Balb/c小鼠的ESCs经过模拟体内神经系统发育过程经过序贯诱导方法可以高效的诱导为神经细胞,且所获得的神经元比例高.