分别含K88,K99和LT-B亚单位抗原基因的重组痘苗病毒的构建

本文构建了分别含K88,K99和LT-B亚单位抗原基因的重组痘苗病毒,并观察了这3种基因的表达情况。首先将K88亚单位基因克隆入痘苗转移或体PGJP-5中,得到嵌合质粒P_5-K88,将K99和LT-B亚单位基因分别克隆至痘苗转移载体PJ16中,得到重组质粒PJK-9和PLT-B。再经细胞体内同源重组技术,将以上3种基因分别插入到痘苗病毒天坛株的TK基因中,经5-BUdR的选择压力在人TK~--143细胞中挑选TK~-表型病毒,分别以相应的~(32)P标记的基因片段为探针进行杂交筛选重组病毒株。我们得到7株含K99亚单位基因的重组病毒V-K99(Ⅰ～Ⅷ),5株含K88亚单位基因的重组病毒V-K88(Ⅰ～Ⅴ);1株含LT-B亚单位基因的重组病毒V-LTB,ELISA检测结果表明,在以上3种重组病毒感染的人TK~--143细胞培养液和细胞裂解物中均未测出相应的基因表达产物。以上结果表明这3种基因可能不易在痘苗系统内有效表达。     

人黑色素瘤细胞系p16基因第二外显子序列分析

人黑色素瘤细胞系ｐ１６基因第二外显子序列分析张劲风①⒇贺晓慧①韩素文②洪美玲①王秉仪①陈广祥①赵先碧①李庆①关键词黑色素瘤基因中图法分类号Ｒ７３０．２ＭＴＳ１／ｐ１６ＣＤＫ４Ｉ基因（ｐ１６基因）是新近发现的与多种肿瘤发生有关的多肿瘤抑制基因（ｍｕｌｔ...     

人尿激酶原工程细胞株CL—11G细胞外源因子的检测

目的：对工程细胞株的要求之一是不应被外源因子污染。因此有必要对表达人尿激酶原的工程细胞株ＣＬ－１１Ｇ进行外源因子的检测。方法：用普通肉汤,改良马丁和硫乙醇酸盐三种培养基对ＣＬ－１１Ｇ细胞进行培养,检查细菌和霉菌;用培养法;ＤＮＡ荧光染色法,单克隆抗体免疫荧光法及电镜检查支原体。用ＣＬ－１１Ｇ细胞悬液分别接种乳小鼠,成年小鼠,豚鼠,家兔,鸡胚及５种细胞,检查有无内外源性病毒污染。结果：ＣＬ－１１Ｇ细     

以痘苗病毒为载体表达乙型肝炎病毒表面抗原

含有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的重组痘苗病毒,一方面表达时能将HBsAg分泌到组织培养上清液中,另一方面它本身可能发展成一种新的活疫苗,故颇受学者们的重视.我们将pA01-HBV质粒酶切回收含有HBsAg基因的BamHI片段,插入至PGJP-5痘苗载体质粒的P7.5启动子之后,使插入的方向与P7.5转录方向一致,构成P_5-S_(40)重组痘苗转移载体质粒.用P_5-S_(40)质粒DNA通过磷酸钙沉淀法转染已感染TK~+天坛株痘苗病毒的CV-1细胞,使重组质粒DNA与痘苗病毒基因组在CV-1细胞体内进行同源重组.以痘苗病毒TK基因的插入灭活为筛选标记,得到的重组病毒应为TK~-表型,在5溴脱氧尿苷(BUdR50μg/ml)存在条件下,以人TK_(143)~-细胞筛选出单个的TK~-噬斑,于人TK_(143)~-细胞(含BUdR)传2～3代,再繁殖一代(不含BUdR),当细胞出现病变时,吸取上清以     

二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体—突变体人TNFα融合基因在CHO（dhfr^—）细胞中的表达

目的：提高抗肝癌靶向人肿瘤坏死因子（hScFv25-hTNFα)的稳定性和杀伤活性,构建二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体－突变体人TNFα融合基因（ds-ScFv-hTNFα）,并在CHO细胞中表达。方法：常规构建ds-ScFv-hTNFα融合基因,并克隆入真核表达载体pCI(dhfrl）,磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO－dhfr^-）,甲氨蝶呤（MTX）高压筛选高表达细胞株,免疫荧光染色和MTT法检测重组蛋白的抗体和突变体hTNFα的双重活性。结果：目的基因在CHO（dhfr^－）中获得了表达,表达产物具有抗体和突变体hTNFα的双重活性,且稳定性得到大幅度提高,达到4℃放置4个月活性无明显下降。结论：抗肝癌人源化ds-ScFv-hTNFα融合基因在CHO细胞中获得功能性表达,为进一步的临床应用研究奠定了基础。     

人白介素6在CHO细胞中的克隆与表达

本研究通过引物设计、转译优化、ＤＮＡ体外重组等技术，构建了ｐＳＶ２·ＩＬ６重组质粒，利用磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷型（ＣＨＯｄｈｆｒ－）株，经选择培养基筛选及逐渐提高甲氨蝶呤（ＭＴＸ）的浓度加压基因共扩增法，获得一株稳定表达人ＩＬ６的细胞株，用ＩＬ６依赖的杂交瘤细胞株７ＴＤ１测定细胞上清液的ＩＬ６生物学活性为１．９×１０５Ｕ／（１０６细胞·ｄ）。     

培养细胞分泌的血纤维蛋白溶酶原激活物的研究

建立了测定血纤维蛋白溶酶原激活物(PA)活性的溶解圈法。敏感性能测出0.01IU尿激酶(UK)活性。在0.02IU至1IU之间UK浓度的对数与溶解圈直径呈线性关系。本法操作简单、敏感、不需特殊仪器,尤其适用于同时检测多份低含量PA样品。本工作证明20种(25株)细胞中有5种能分泌UK,有5株人黑色素瘤细胞能分泌tPA。其中A549、IB-RS-1及LLCMK_2能分泌UK;MM96L、MM253及MM138能分泌t-PA为我们首次确定。     

酸性尿素琼脂糖凝胶电泳检测RNA

酸性尿素琼脂糖凝胶电泳检测RNA,方法简便,容易掌握。我们对不同来源的RNA进行了检测,分辨力较好,可以回收具有活性的RNA;RNA分子量与泳动距离基本上呈线性关系。     

人尿激酶原cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的高效表达

尿激酶原(prourokinase,pro-UK)亦称单链尿激酶,是一种由411个氨基酸残基组成、分子量为54kDa的糖蛋白,经纤溶酶(p1asmin)作用变成尿激酶(又称双链尿激酶);它与尿激酶不同,能特异性作用于血栓,激活溶血系统,临床应用时不易引起全身性出血,是一种很有希望的新型溶血栓制剂,但自然界中含量甚微,难于大量制备。于是,人们希望通过基因工程手段来获得大量的尿激酶原。1989年,本实验室方继明等人在国内首次获得了pro-UK全长cDNA克隆,随后在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达了有生物活性的尿激酶原,表达量为每24h 50～60IU/10~6细胞,但这一表达