粪肠球菌群体感应系统luxS基因的研究

目的研究粪肠球菌群体感应系统luxS基因的功能并体外合成AI-2信号分子,为研究粪肠球菌LuxS/AI-2依赖的群体感应系统提供依据。方法以哈氏弧菌BB170作为报告菌株,检测3株粪肠球菌培养上清的AI-2活性,然后从粪肠球菌中扩增出luxS和pfs基因,测序和比对氨基酸序列,并将两基因插入到pGEX-4T-1表达载体中,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中实现表达与纯化,进而以S-腺苷高半胱氨酸为底物、纯化的蛋白或构建的大肠杆菌菌体蛋白为反应酶,体外合成AI-2。结果 3株粪肠球菌均能够分泌有活性的AI-2信号分子;LuxS蛋白序列分析发现其与哈氏弧菌、沙门菌、大肠杆菌具有高度同源性;SAH均可以与纯化的蛋白或构建的大肠杆菌菌体蛋白合成出有活性的AI-2分子。结论粪肠球菌存在LuxS/AI-2依赖的群体感应系统,AI-2的产生依赖于luxS基因。     

长双歧杆菌BL0033与BL0034的相互作用研究

目的克隆表达B.longum NCC2705果糖ABC转运系统中BL0033、BL0034及其截短突变体,验证两蛋白的体外相互作用,并确定介导彼此相互作用的功能区域。方法将bl0033与bl0034基因克隆至载体pGEX-4T-1和pET32a并在E.coli中表达,采用谷胱甘肽-Sepharose 4B和镍柱分别对GST和His融合的蛋白进行纯化,GST pull-down验证BL0033与BL0034蛋白之间的相互作用。为了进一步确定BL0033和BL0034的作用位点,根据BL0033和BL0034基序特征构建截短突变体,GST pull-down实验检测截短体与完整蛋白结合的能力,确定介导相互作用的区域。结果在大肠杆菌中实现了融合蛋白的可溶性表达,经亲和层析获得了融合蛋白。GST pull-down实验证实BL0033与BL0034存在相互作用,其中BL0033的截短体1～23 aa能与BL0034结合,而截短体36～314 aa丧失了与BL0034的结合能力;BL0034的3个截短体中BL0034/8～244 aa、BL0034/33～220 aa能与BL0033相互作用,而BL0034/289～481 aa与BL0033没有作用。结论证实了BL0033与BL0034之间的相互作用,并确定BL0033的1～23 aa基序与BL0034的33～220 aa基序是这种相互作用的结构域,为进一步研究B.longum NCC2705果糖ABC转运系统的分子机制奠定了理论基础。     

乙肝肝硬化患者肠道微生物元基因组学的研究

目的比较分析乙肝肝硬化患者与正常人远端肠道微生物群的差异,探讨乙肝肝硬化与肠道微生物群变化的关系。方法选取11例乙肝肝硬化患者及20例正常人,提取其肠道微生物元基因组,采用高通量Solexa测序方法,通过基因比对、主成分分析、属种定量及功能代谢组成等生物信息学分析方法,找出疾病相关的属种和基因信息。结果与结论属种定量及组成分析发现,乙肝肝硬化患者存在不同程度的肠道菌群失调,表现为肠杆菌科（尤其是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和志贺菌属）以及韦荣球菌属富集（P〈0.05）,拟杆菌属缺失（P〈0.05）;功能及代谢分析发现,乙肝肝硬化患者富集较多的执行氨基酸和碳水化合物膜转运及代谢功能的基因。