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背景与目的:在前期工作中,我们经计算机序列分析发现,在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因组增强子Ⅰ上游1047~1059 bp存在P53样应答元件结合序列5′-TGCC(G)TTGCCT-3′,体外实验应用凝胶迁移方法(EMSA和EMSSA)发现这段序列与P53蛋白能够进行特异性结合.本实验拟观察肝癌细胞中P53蛋白与HBV基因组P53样应答元件结合序列之间的关系.方法:报告基因质粒pX-CAT上游为X基因增强子和启动子序列,其中含有P53样应答元件结合序列5′-TGCGTTGCCT-3′.首先用PCR方法将pX-CAT质粒中5′-TGCGTTGCCT-3′进行点突变,成为5′-TGTATTGTAT-3′,以破坏P53样应答元件结合序列.将pX-CAT和变异后的pX-CAT(mpX-CAT)分别单独或与pCMV-p53质粒共转染HepG2细胞,通过检测报告基因CAT的活化情况,观察P53蛋白与这段DNA序列的作用关系.将HBV基因P53样应答元件结合序列反向构建于真核表达质粒pZeoSV2中(αpZeoXP),转染HepG2.2.15细胞并稳定筛选,以封闭HBV基因上P53样结合位点,观察细胞中P53/P21蛋白表达的改变,以及细胞周期、细胞凋亡的变化.结果:HepG2细胞中,报告基因CAT活性在pCMV-p53与pX-CAT共转染组较pX-CAT单独转染组明显升高(1.353 vs 0.738,P<0.05),而mpX-CAT单独转染组CAT活性则明显降低(0.304),即使与pCMV-p53共转染CAT活性也较低(0.402).与对照组相比,稳定转染了αpZeoXP的HepG2.2.15细胞中,P53、P21蛋白表达水平降低;细胞周期检测显示,与对照组相比,处于S期的细胞数增多(16.37%vs 9.48%),而细胞凋亡数减少(0.95%vs7.84%).结论:P53可促进pX-CAT报告基因在细胞内的表达,进一步提示P53与HBV增强子上游5′-TGCC(G)TTGCCT-3′序列存在结合作用,二者作用可能通过导致细胞内P53蛋白半衰期延长,而使细胞中P53及其下游基因P21蛋白表达水平和活性升高. 相似文献
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不同p53状态的肝癌细胞系DNA损伤修复能力的比较 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 观察不同p53状态的肝癌细胞在DNA损伤因素存在下,探讨p53在肝细胞癌发生过程中的作用。方法 选用内源性表达野生型p53、突变型p53、p53全基因缺失的HepG2、PLC/PRF/5、Hep3B肝癌细胞系,将含有p53结合序列的CAT报告基因质粒分别转染各细胞,通过ELISA方法检测报告基因CAT活化情况,观察p53功能状态;用细胞生长曲线比较不同p53状态的细胞生长速度的差异;给予一定剂量的紫外线照射,检测各细胞程序外DNA损伤修复(UDS)能力;观察紫外线照射后细胞克隆形成情况,反映不同细胞系在紫外线照射后细胞存活率的不同。结果 报告基因CAT在HepG2细胞表达最强,而在PLC/PRF/5、Hep3B肝癌细胞均处于较低水平,说明HepG2细胞具有功能性的p53表达;HepG2细胞生长速度明显慢于其他两种细胞;紫外线照射后,HepG2具有较好的DNA损伤修复能力以及较高的细胞生存率。结论 野生型p53具有抑制肝癌细胞生长、保持细胞良好的DNA损伤修复的功能。 相似文献
3.
进展期肝癌患者氩氦刀冷冻消融术前中性粒细胞/淋巴细胞比值与术后预后关系研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的探讨氩氦刀术前中性粒细胞/淋巴细胞比值(neutrophil/lymphocyte ratio,NLR)与进展期肝癌患者术后生存期的关系。方法回顾性分析2008—2009年在我院行氩氦刀冷冻消融治疗的150例进展期肝癌患者临床资料,根据术前NLR中位数(2.94)将患者分为2组(高NLR组和低NLR组),对2组进行生存分析和Cox回归分析。结果氩氦刀冷冻消融术前病理组织分化程度、NLR和肝硬化Child-Pugh分级是术后进展期肝癌患者生存期的影响因素。术前高NLR组患者生存期为5个月(95%CI 3.5~6.4),而低NLR组患者生存期为9个月(95%CI 6.9~11.0),2组生存期差异有统计学意义。结论 NLR2.94的进展期肝癌患者行氩氦刀冷冻消融治疗预后较差。 相似文献
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目的 探讨索拉非尼联合局部冷冻消融治疗进展期乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞癌(HCC)的疗效及安全性.方法 收集2007年7月-2009年9月收治的102例进展期肝细胞癌患者,均为HBV感染,随机分为2组,S+C组(n=50)给予索拉非尼联合冷冻消融治疗,C组(n=52)仅给予冷冻消融治疗.每4~6周按照实体瘤疗效评价标准(RECIST)进行疗效评价,治疗终点为肿瘤进展或出现不可耐受的毒性.按美国癌症研究所的常规毒性判定标准(NCI-CTC)评价治疗后的不良反应,随访生存期及肿瘤进展情况.结果 S+C组2例完全缓解(CR),9例部分缓解(PR),22例疾病稳定(SD),疾病控制率(DCR)为66.0%.C组0例CR,4例PR,19例SD,DCR为44.2%.S+C组患者中位生存期(OS)和中位肿瘤进展时间(TTP)分别为11.0和6.0个月,而C组分别为7.5和3.5个月,两组间差异有统计学意义(P<0.01).S+C组患者出现皮疹、高血压、手足综合征、腹泻、肝功能异常、白细胞减少、上消化道出血等不良反应的比例分别为62%、54%、42%、42%、34%、20%和12%,其中发生3级以上严重并发症的患者分别为4%、2%、22%、6%、6%、4%、6%.结论 索拉非尼联合局部冷冻消融治疗进展期HCC安全、有效,能显著延长进展期HCC患者的生存期及肿瘤进展时间. 相似文献
5.
HBC抗原是乙肝病毒最小编码杠X基因区编码的蛋白,研究证明它与HBV相关性肝癌的发生有关;抑癌基因p53的变异或失活也与肝细胞癌(HCC)的发生密切相关。研究HBX抗原与p53的相互作用关系,有助于进一步揭示HBV相关性肝癌的发病机制。 相似文献
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p14ARF基因通过p53途径对肝癌细胞的生长的影响 总被引:5,自引:2,他引:5
目的 探讨 p14 ARF对含有野生型 p5 3(wtp5 3)的肝癌细胞生长的影响及其作用机制。方法 将含p14 ARF的基因转染到人肝癌细胞HepG2中 ,通过流式细胞仪及生长曲线观察其对HepG2细胞周期及细胞生长的影响。利用Western Blotting方法及 p2 1waf1启动子荧光素酶活性检测p14 ARF对HepG2细胞 p5 3蛋白表达的影响。 结果 转染p14 ARF基因的HepG2细胞的生长速度从第 3天开始较空载体 pcDNA 3组减慢 ,处在G0 G1期细胞数 ( 70 .6 6 % )与空载体组 ( 6 1.5 5 % )相比明显增加 ,转染 pcDNA3p14 ARF( 1.0 92 3± 0 .0 370 ) p2 1waf1启动子荧光素酶活性较空载体组( 0 .76 73± 0 .0 180 )明显升高 ( P <0 .0 5 )。Westernblotting结果表明 ,p5 3表达也明显增加。 结论p14 ARF基因通过上调HepG2细胞的 p5 3表达导致 p2 1waf1的表达升高使细胞阻滞于G0 G1期 ,从而抑制细胞的生长。 相似文献
8.
目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCV FTP2基因.方法以HepG2细胞来源的mRNA作为模板,经过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HCV FFP2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot免疫印迹分析.结果成功构建HCV FTP2基因酵母表达载体,Western blot免疫印迹显示HCV FTP2基因在酵母细胞中表达成功.表达产物相对分子质量27kD.结论HCV FTP2在酵母中表达成功. 相似文献
9.
目的:研究刀豆素A(ConA)能否诱发昆明小鼠特发性肝损害。方法:ConA将刀豆素A用于昆明小鼠,并成功地诱发了T细胞介导的特异性肝脏损害。结果显示:该实验模型所造成的肝脏损害为ConA剂量依赖性:肝组织病理示,门管区大量淋巴细胞浸润,并可见点片状肝细胞坏死。以环孢霉素A(CSA)预先抑制T淋巴细胞活化,则未见肝脏损害,肝组甥病理也未发现淋巴细胞的浸润。结论:该实验模型进一步验证了ConA性肝损害为无种属特异性的T细胞依赖性肝损害模型,同时也为深人研究病毒性肝炎、自身免疫肝病等病理机制提供了又一方便、理想的实验模型。 相似文献
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目的利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建重组干扰素β(IFNβ)刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选IFNβ下凋HepG2相关基因。方法重组IFNβ2000U/ml刺激对数生长期HepG2细胞,以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对照;制备细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两份,分别与两种不同的接头连接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建重组IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后,得到58个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200~1000bp插入片段。随机挑选其中35个插入片段测序,并通过生物信息学分析,结果共获得12种编码基因。结论应用SSH技术成功构建了IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步了解IFNβ在肝细胞内的免疫调节机制提供了依据。 相似文献