大鼠脑梗死后乏氧组织变化与血管增生的关系

目的： 探索脑梗死后乏氧组织的变化与血管增生的关系。方法：利用大鼠脑缺血1.5 h再灌注（1.5 h IR组）和持续缺血（PI组）的线栓模型,采用2-(2-硝基-1氢-硝基咪唑-1-羟基)-氮-（2,2,3,3,3-5氟嘌呤）乙酰唑胺（EF5）和血管性假性血友病因子 (vWF)免疫荧光方法观察乏氧组织和微血管密度（MVD）,比较2组术后3 d、7 d、14 d缺血侧大脑半球皮层的MVD以及与乏氧组织的关系。结果： 1.5 h IR组术后3 d、7 d、14 d均见乏氧组织存在,PI组乏氧组织仅存在3 d,假手术组不存在乏氧组织。各观察时点的乏氧组织内部MVD均较周围区域的MVD小（均P<0.01）。随着时间的延长,1.5 h IR组和PI组的皮层MVD均不断增大（均P<0.01）,而1.5 h IR组7 d和14 d的皮层MVD均高于PI组（均P<0.01）。结论： 脑梗死后乏氧组织出现在微血管稀疏的区域。微血管增生程度的差异是导致乏氧组织持续时间不同的原因之一。     

脑缺血再灌注早期梗死灶边缘区TLR9信号通路的活化

目的 观察大鼠脑缺血再灌注早期梗死灶边缘区皮层Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)信号通路的活化情况.方法 制备Sprague-Dawley(SD)大鼠短暂大脑中动脉闭塞模型,缺血90 min后再灌注,随机分两组:6 h组(n=5)和3 d组(n=5),分别采用RT-PCR、Western-blot法测定梗死灶边缘区皮层TLR9、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、干扰素调节因子7(interferon regulatory factor 7,IRF7)、干扰素-β(interferon-beta,IFN-β)的mRNA及蛋白表达.结果 6 h和3 d组TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β的mRNA表达量分别为(0.43±0.03)和(0.93±0.03)、(1.21 4±0.11)和(2.26±0.16)、(0.44±0.04)和(1.27±0.17)、(0.15±0.02)和(0.26±0.03),蛋白表达量分别为(0.75±0.04)和(1.35±0.04)、(0.93±0.04)和(1.05±0.02)、(0.54±0.03)和(0.73±0.02)、(0.82±0.02)和(0.93±0.03)(组间比较,均P<0.01).同组内TNF-α的表达明显高于IFN-β的表达(均P<0.01).结论 TLR9信号通路在脑梗死早期的炎症反应中可能起重要作用.     

氧葡萄糖剥夺-再恢复后抑制小胶质细胞TLR9激活对神经元的保护作用

目的:观察氧葡萄糖剥夺-再恢复(OGDR)后小胶质细胞BV-2 Toll样受体9(TLR9)激活对神经元凋亡的影响。方法:对BV-2细胞或TLR9-siRNA转染的BV-2细胞进行OGDR处理4 h后,将细胞上清添加至OGDR处理4 h的小鼠原代皮层神经元中,继续正常培养24 h后,倒置显微镜下观察神经元形态变化,TUNEL染色检测神经元凋亡,Western blotting检测神经元caspase-3蛋白的表达。实验分为正常BV-2组、negative control-siRNA组、TLR9-siRNA组、OGDR组、OGDR+NC-siRNA组、OGDR+TLR9-siRNA组和对照组(神经元OGDR后不添加BV-2细胞上清)。结果:OGDR后神经元胞体肿胀,折光性下降,出现空泡样变,轴突变细、扭曲、断裂。TUNEL染色各组均可见绿染凋亡小体。与对照组比较,其它组的caspase-3蛋白表达升高(P0.05);与正常BV-2组比较,OGDR组和TLR9-siRNA组的caspase-3蛋白表达升高(P0.05);OGDR+TLR9-siRNA转染组与TLR9-siRNA转染组和OGDR组比较,caspase-3蛋白表达下降(P0.05)。结论:OGDR后BV-2细胞TLR9激活致神经元凋亡增多,caspase-3蛋白表达升高;抑制TLR9表达后,神经元损伤减轻。     

小鼠脑梗死后小胶质细胞内Toll样受体9选择性上调

 目的：观察脑梗死后Toll 样受体9（TLR9）表达量及其在神经元和神经胶质细胞中的表达变化。方法：线栓法制备C57小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型,90 min后再灌注。假手术组为对照。再灌注后6 h、3 d、7 d和14 d处死动物 (n=3),制备脑冠状位冰冻切片。免疫荧光染色观察TLR9表达量及其在神经元和神经胶质细胞中的表达变化。结果：梗死灶边缘区TLR9的表达量随时间增加,始终高于对侧及假手术组。病变全程偶见神经元胞内小点状TLR9,TLR9阳性率无时间、组间差异。激活态小胶质细胞聚集于梗死灶边缘区,胞内TLR9由散在小点状变为团块状粗颗粒样。TLR9阳性率随时间先升后降,始终高于对侧及假手术组。星形细胞和少突胶质细胞未见TLR9阳性染色。结论：脑梗死后,中枢定居细胞中神经元TLR9维持固有表达,仅小胶质细胞TLR9表达选择性上调,星形细胞及少突胶质细胞无TLR9表达。     

羟基红花黄素A对脑缺血再灌注后缺血半暗带自噬活性的调节作用

目的:探讨脑缺血再灌注后羟基红花黄素A(hydroxysafflor yellow A,HYSA)对缺血半暗带自噬活性的调控机制。方法:构建雄性SD大鼠脑缺血90 min再灌注模型,分为假手术组、脑缺血再灌注(cerebral ischmia/reperfusion,I/R)组、I/R+HSYA组和假手术+HSYA组,分别在再灌注后6 h、1 d、3 d和7 d对大鼠进行改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score,m NSS),同时检测缺血半暗带的自噬活性、凋亡及干扰素β(IFN-β)表达。结果:与假手术组比较,I/R组缺血半暗带在6 h~7 d内可见LC3-Ⅱ蛋白表达增高及SQSTM1/P62蛋白降解,提示自噬激活;与I/R组比较,I/R+HSYA组的自噬活性在1 d和3 d时明显升高(P0.05),7 d时则明显降低(P0.05)。同时,I/R组的IFN-β表达较假手术组在6 h时升高(P0.05),1 d和3 d时降低(P0.05),7 d时恢复正常;而I/R+HSYA组的IFN-β表达在1 d和3 d时明显高于假手术组和I/R组(P0.05),并且3 d时的细胞凋亡少于I/R组,m NSS评分自4 d起明显低于I/R组(P0.05)。结论:HSYA可动态调节缺血半暗带的自噬活性和IFN-β表达,从而改善脑缺血再灌注损伤。     

Bell麻痹早期治疗的临床研究

目的探讨Bell麻痹早期治疗的最佳方法。方法将103例Bell麻痹急性期患者随机分为地塞米松合用三七总皂苷组（35例，A组）、地塞米松组（34例，B组）、三七总皂苷组（34例、C组），各组基础治疗均采用泛昔洛韦等药物及早期康复治疗，均在发病7d内给予相应治疗。采用H-B面神经功能恢复评定标准，分别于治疗前后评定面神经麻痹等级。结果治疗前三组H-B面瘫等级分布具有可比性。治疗1个月三组患者H-B面神经功能恢复经K-W秩和检验，P值为0．001，P〈0．05，差异有统计学意义，三组间每两组比较，A组面神经功能恢复优于B组与C组，差异有统计学意义（P值分别为0．003，0．002，P值均小于0．05）；而B组与C组之间面神经功能恢复无明显差异，差异无统计学意义（P值为0．393、P〉0．05），按百分比做疗效比较，结果三组总有效率均分别为100％，治愈与显效总和：A组为97％，B组为68％，C组为59％。A组疗效明显优于B、C组，而B、C组间疗效大致相同。结论地塞米松合用三七总皂苷综合治疗对Bell麻痹的效果明显优于单纯一种药物治疗。     

BOLD-fMRI方法探讨尤瑞克林治疗急性脑梗死的疗效及其作用机制

目的 通过血氧水平依赖功能磁共振成像(BOLD-fMRI)的方法 观察尤瑞克林治疗急性脑梗死的疗效及其作用机制. 方法 将23例急性脑梗死患者按随机数字表法分成对照组(11例)和治疗组(12例),对照组给予常规治疗,治疗组在常规治疗的基础上加用尤瑞克林,疗程均为12～14d.观察治疗前后BOLD-fMRI影像和患侧手食指肌力评分和美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分的变化. 结果 治疗后,治疗组息侧感觉运动皮层(SMC)激活频率和激活体积较治疗前明显增加(11/12 vs 4/12;199.58±169.41 vs 105.17±197.23),且治疗前后激活体积之差明显大于对照组(94.42±51.57 vs 16.09±106.61),差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,治疗组患侧食指肌力评分和NIHSS评分较治疗前明显改善(2.67±1.44 vs 1.25±1.48;4.92±2.94 vs 10.42±3.80),且治疗前后NIHSS评分之差明显大于对照组(5.50±1.31 vs 3.18±2.48),差异有统计学意义(P<0.05). 结论 促进脑功能区SMC的激活恢复可能是尤瑞克林治疗脑梗死的一个重要机制.     

有效抑制小鼠小胶质细胞上Toll样受体9表达的siRNA的筛选

目的：筛选有效抑制小鼠小胶质细胞（BV-2细胞）上Toll样受体9（TLR9）表达的小干扰RNA（siRNA）序列,并检测转染复合物的细胞毒性。方法设计并合成针对TLR9的3对siRNA（siRNA-836、siRNA-1549和siRNA-2410）及一条带绿色荧光标记（FAM）的通用阴性对照FAM-siRNA。在X-tremeGENEsiRNA转染试剂介导下转染BV-2细胞。倒置荧光显微镜下观察转染后BV-2细胞FAM-siRNA的分布,流式细胞仪检测转染效率,q-PCR检测TLR9的mRNA表达,Westernblot检测TLR9蛋白的表达,并比较其抑制率,筛选出有效抑制靶基因表达的siRNA。CCK-8检测细胞存活率的变化。结果BV-2细胞转染FAM-siRNA后6h,胞质内可见绿色荧光分布。FAM-siRNA表达阳性率为（91.87±4.77）％。转染TLR9siRNA后,BV-2细胞中TLR9mRNA表达明显下降。与阴性对照组及序列siRNA-836、siRNA-2410相比,序列siRNA-1549的TLR9沉默效能最高,使BV-2细胞上TLR9mRNA表达于24h和48h分别降低（77.89±4.23）％和（65.36±11.07）％,TLR9蛋白表达分别下降（48.37±20.56）％和（44.30±14.31）％。CCK-8检测TLR9siRNA转染组与对照组相应时间点比较,BV-2细胞存活率无明显变化（P＞0.05）。结论序列siRNA-1549对BV-2细胞上TLR9表达的抑制效果最大,利用RNA干扰处理BV-2细胞,对细胞基本无毒性作用。     

TLR9信号通路在大鼠脑梗死灶周围组织中的双向转导

目的 观察Toll样受体9(TLR9)信号通路在大鼠脑梗死灶周围皮质组织中的转导变化. 方法 采用线栓法成功制备48只SD大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,并设置假手术组(24只)作为对照.在脑缺血90 min再灌注6h、3d、7d、14d时分别对大鼠进行神经功能缺损评分,取脑组织行TTC染色以测定梗死体积,取梗死灶周围皮质和对侧相应皮质行Western blotting,测定TLR9、核因子NFκB(P65)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、干扰素调节因子-7(IRF7)、干扰素-3(IFNβ)的蛋白表达水平. 结果 再灌注6h、3d、7d、14d时,模型组大鼠的神经功能缺损评分和梗死体积随时间的延长逐渐减小;梗死侧TLR9、IRF7、IFNβ蛋白的表达逐渐增加,而NFκB(P65)、TNFα蛋白的表达呈先上升后下降的趋势,表达高峰在7d.同一蛋白的表达量在不同时间点间比较差异均有统计学意义(P＜0.05);同一观察时间点比较,梗死侧各蛋白的表达量高于对侧相应皮质,差异有统计学意义(P＜0.05).再灌注6h、3d和7d时NFKB(P65)、TNF-α蛋白表达分别高于IRF7、IFNβ,而再灌注14d时NFκB(P65)、TNFα蛋白表达分别低于IRF7、IFNβ,差异均有统计学意义(P＜0.05).在假手术组各时间点均未检测到上述蛋白的表达. 结论 大鼠短暂性脑缺血再灌注后,TLR9的炎症通路和细胞保护通路相继被激活,可能参与了脑梗死后炎症损伤和组织修复过程.