PCR技术在肉类成分定量分析中的应用研究进展

PCR技术具有特异性强、灵敏度高、可同时分析大量样本的特点,在鉴别和定量分析食品中肉类成分上应用广泛。本文介绍了PCR扩增产物分析、实时荧光PCR和微滴数字PCR三种应用于肉类定量的技术,通过检出限、定量限和定量范围等数据分析这三种方法在肉类成分定量分析中的应用效果,并对其定量的局限性进行阐述,为进一步完善PCR定量技术提供参考。      

加工方法对猪肉成分RQ-PCR检测结果影响的研究

为评价不同加工处理方法对肉制品猪肉成分实时定量PCR(RQ-PCR)检测结果的影响,研究建立混合肉制品标准品(猪肉质量百分比0.05%~20%),采用5种方法(煮制、微波加热、超声波、烤制、高温高压灭菌)对混合肉制品进行处理,提取肉制品总DNA,采用RQ-PCR扩增线粒体细胞色素b(Cytb),以真核生物18S r RNA为内参,通过△Ctt建立标准曲线并进行相对定量,比较△Ct之间的差异,并由此判断不同加工方法对相对定量的影响,结果显示,不同的加工处理方法均能引起DNA的降解。而通过RQ-PCR检测发现,虽然Ct值随DNA降解程度加深而升高,但△Ct变化较小。因此,△Ct法可作为分析肉制品中猪肉成分的可靠定量手段。     

多种绿色DNA嵌入染料实时荧光PCR检测猪DNA效果比较

实时荧光定量PCR是食品科学领域一种高效、灵敏的研究技术,荧光染料的种类和浓度会对实时PCR反应产生一定影响。以8种绿色荧光DNA嵌入染料SYTO 11~14,SYTO 16,SYTO 21,SYTO 24~25为研究对象,体系选择荧光染料浓度分别为10,5,2,1,0.5μmol/L,以从猪肉中提取的基因组DNA为模板进行扩增,产物长度149 bp。通过分析Ct值和熔解曲线,评价染料浓度对扩增效果的影响,初步筛选出最适染料及相应浓度:SYTO 11(5μmol/L,2μmol/L),SYTO 13(10μmol/L,5μmol/L),SYTO 16(10μmol/L,5μmol/L),SYTO 21(1μmol/L)和SYTO 24(0.5μmol/L)。根据筛选结果自配反应预混液,以2种商业实时荧光PCR预混液为参照,通过模板10倍梯度稀释绘制标准曲线,计算扩增效率,R2均大于0.99,线性范围均在40 ng~0.04 pg之间,其中染料SYTO 13(10μmol/L)和SYTO 16(10μmol/L,5μmol/L)扩增效率分别为99.35%,100.50%和99.71%,接近商业试剂盒2(BYRT染色,扩增效率99.61%),高于商业试剂盒1(Evagreen染色,扩增效率97.80%),具有实际应用价值。