人组织型纤溶酶原激活剂转基因功能鸡蛋的研究及其活性分析

为探索人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在鸡卵黄中积淀的可行性,开发具有抗心血管疾病的功能性鸡蛋,应用分子生物学技术分别构建含有人t-PA 基因和t-PA 与鸡卵黄高磷蛋白融合基因的真核表达质粒pcDNA3-tPA 和pPhosvitin-tPA,脂质体包裹后分别注射于初产蛋鸡的肝脏,Western blotting 和ELISA 检测t-PA 基因在鸡肝脏中的表达和在卵黄中的积淀情况,琼脂糖平板溶圈法检测期其活性。结果显示,注射重组质粒后7d,卵黄中有分子质量为63kD 的t-PA 积淀,表达可持续5 周,高峰表达量分别为39.16mg/L 和53.92mg/L;琼脂糖平板溶圈法检测其活性表明,卵黄中的t-PA 具有激活组织纤溶酶的活性。实验证明了外源基因表达产物在卵黄中积淀这一途径的可行性。     

甘草多糖对单核细胞增生性李斯特菌体内外生长的影响

目的：探讨甘草多糖对单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes,Lm）体内外生长的影响。方法：采用平板计数法和荧光显微镜、分光光度法及Bliss法分别分析甘草多糖对Lm生长速率和生物被膜形成的影响及计算细菌对小鼠半数致死量（median lethal dose,LD50）。观察低剂量（1 mg/kg）、中剂量（10 mg/kg）和高剂量（100 mg/kg）甘草多糖对感染100×LD50 Lm小鼠的保护力。小鼠感染0.01×LD50的Lm后1、7、14、21、28、35 d剖杀小鼠,检测脾脏、肝脏和肺脏中Lm分布的消长情况。结果：低质量浓度时（10、20、50 μg/mL）,甘草多糖随着质量浓度增加对Lm标准菌株10403S生长速率和生物被膜形成的促进作用呈上升趋势;但高质量浓度时（100、200 μg/mL）这种促进作用逐渐降低。Lm口服感染小鼠的LD50为2.70×108 CFU。高剂量甘草多糖对于100×LD50的Lm感染可提供50%的保护力。0.01×LD50的Lm感染小鼠,随着甘草多糖质量浓度增加小鼠脾脏、肝脏和肺脏的细菌量逐渐减少。结论：低质量浓度甘草多糖在体外对Lm的生长具有促进作用,但随着质量浓度增高促进强度逐渐降低,而甘草多糖可以提高小鼠抵抗Lm感染的能力。     

黄曲霉毒素B1降解菌的筛选及生物学特性分析

筛选具有降解黄曲霉毒素B₁（aflatoxin, AFB₁）的菌株以用于黄曲霉毒素的生物降解。该实验采用以香豆素为唯一碳源的培养基进行初筛,采用ELISA试剂盒检测初筛菌株AFB₁降解率的方法进行复筛,然后通过测定筛选菌株的生长曲线,对酸、胆碱、肠胃液的耐受性以及抑菌性能,对其抗逆性和抑菌性进行初步分析。通过初筛和复筛,筛选到1株具有较强的AFB₁降解能力的菌株ZJ20,其降解率可达84.23%,经形态学观察、生理生化试验及16S rRNA序列测定,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,将其命名为Bacillus subtilis ZJ20。菌株Bacillus subtilis ZJ20耐酸处理后存活率在69.11%以上,胆盐处理后存活率在68.12%以上,人工胃肠液中处理后存活率在62.39%以上,抑菌实验结果表明该菌对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica subsp）ATCC14028、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus）A...     

双纤维素酶基因在乳酸杆菌中的融合分泌表达

为提高纤维素的降解效率,将两种不同的纤维素酶基因在乳酸杆菌中融合表达,实现双纤维素酶在乳酸杆菌中的高效表达。根据两纤维素酶的基因序列设计两对引物,并在两基因间引入一段连接肽。通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）分别扩增得到两纤维素酶基因CelL15和CelL73,将其融合后连接到乳酸杆菌分泌性表达载体pMJ67中,构建重组表达质粒pMJ-CelL15-CelL73,电转化入乳酸杆菌Lactobacillus casei,利用红霉素MRS平板筛选阳性克隆,通过PCR验证获得了分泌表达双纤维素酶的重组乳酸杆菌。电泳实验结果表明重组乳酸杆菌成功表达了1 个约为83 kD的融合蛋白。平板酶活力检测发现重组乳酸杆菌能明显降解底物中的羧甲基纤维素钠,培养液上清中纤维素酶酶活力可达1.25 U/mL。     

降胆固醇乳酸杆菌的筛选及对小鼠血清胆固醇的影响

目的：从羊新鲜粪便中分离筛选具有降胆固醇能力的乳酸杆菌,探讨其对小鼠血清胆固醇含量的影响。方法：以碳酸钙-MRS培养基和胆固醇-MRS培养基筛选具有高效降胆固醇能力的乳酸杆菌;利用形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析鉴定分离菌株L-3。为了验证其效果,将40 只8 周龄雄性BALB/c小鼠随机分为基础饲料组（A）、高脂模型组（B）、高脂模型＋生理盐水组（C）、高脂模型＋菌株L-3组（D）。分别饲喂第15、30天,采血,测定总胆固醇（total cholesterol,TC）、总甘油三酯（triglyceride,TG）和高密度脂蛋白胆固醇（highdensity lipoprotein-cholesterol,HDL-C）的含量。结果：筛选得到一株能够高效降解胆固醇的菌株L-3,胆固醇降解率达到（35.93±0.43）%,经鉴定为植物乳杆菌。饲喂第15天,成功构建出高脂血症小鼠模型。灌胃第30天,与B组相比,D组TC、TG、动脉硬化指数水平均极显著降低（P＜0.01）,HDL-C水平显著升高（P＜0.05）,HDL-C/TC水平极显著升高（P＜0.01）,而对照组几乎无降胆固醇效果（P＞0.05）。结论：实验获得了1 株在体内外均具有高效降胆固醇能力的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum L-3,为进一步开发其为功能性微生态制剂提供了可能。     

降解玉米赤霉烯酮菌株的筛选、降解机制及特性研究

玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是一种易于污染谷物和饲料的雌激素类真菌毒素,严重危害人类和动物健康。采集霉变饲料、土壤等样品,以ZEN为唯一碳源的培养基进行初筛,采用ELISA法筛选对ZEN的降解能力较强的菌株。采用形态学和分子生物学方法对菌株进行鉴定。对菌株的菌体、上清液、细胞内容物分别进行降解实验,探讨其降解机制。研究不同温度、pH、接种量和时间对菌株降解效率的影响。接种到污染ZEN（1 μg/mL）的原料,评价筛选菌株对原料中ZEN的降解效率。通过小白鼠攻毒试验评价菌株的安全性。结果表明从96个分离菌株中筛选出1株ZEN降解能力较强的菌株G-6,最高达到81.19％。菌株为G+,呈杆状,中等大小,能够形成芽孢。16S rDNA序列分析表明G-6和解淀粉芽孢杆菌的亲缘关系最近。不同成分降解试验表明该菌株主要是通过细胞分泌的胞外酶降解ZEN。菌株G-6最佳降解ZEN的条件为：温度37 ℃,pH5.0,接种量3％,培养时间72 h。样品毒素降解实验证明菌株均能100％降解可溶性淀粉、玉米粉、豆粕粉中的ZEN。小白鼠试验结果表明该菌株不具致病性,是一种安全菌株。获得了1株高效降解ZEN的解淀粉芽孢杆菌,为ZEN污染食品和饲料的生物脱毒提供了可能。     

一株降解呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的筛选与鉴定

目的:分离筛选能够降解呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)的芽孢杆菌,以用于该毒素的生物降解。方法:采集霉变秸秆、土壤和粪便样品,先将样品加热80℃后,取上清液接种到以DON为唯一碳源的分离培养基富集DON降解菌。以LB培养基分离纯化富集菌,然后对分离到的菌株进行DON毒素降解能力检测。对降解能力最强的菌株进行形态学观察、生理生化实验和16S r DNA序列鉴定。结果:从16株分离菌中筛选得到一株对DON降解能力最强的菌株B.JG05,降解率最高可达80.61%,且对含DON饲料的降解率为82.68%。该菌株呈短杆状,能形成芽孢;生理生化特性符合蜡样芽孢杆菌的基本特征;16S r DNA序列进化树分析表明该菌株与蜡样芽孢杆菌的亲缘关系最近。结论:筛选获得了一株高效降解DON的蜡样芽孢杆菌B.JG05,为饲料和食品中DON毒素的生物降解提供了可能。