禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

为获得禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis virus,AEV)VP1蛋白的单克隆抗体,通过原核表达AEV VP1蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得2株杂交瘤细胞株,命名为4#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示：制备的株单克隆抗体亚型分别为IgG2b、IgG2a,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与AEV发生特异性反应而与其他禽病常见病毒均无交叉反应。运用建立的IFA对单抗进行了初步运用,在外源病毒检测方面与经典方法符合率高。本研究成功制备了AEV单克隆抗体,为进一步建立AEV检测方法和深入研究AEV的生物学特性奠定了基础。     

福建漳州市规模猪场伪狂犬病野毒和猪圆环病毒2型感染的血清学调查

为了解漳州地区猪伪狂犬病野毒和猪圆环病毒2型感染状况,2013—2014年笔者选择漳州市50个规模猪场开展血清学调查。调查结果表明:2013年、2014年规模猪场伪狂犬病野毒抗体阳性率分别为58.8%、51.5%,其中母猪血清学样品阳性率26.4%、35.0%,仔猪血清学样品阳性率19.4%、19.7%;2013年、2014年规模猪场猪圆环病毒2型抗体阳性率分别为64.7%、78.8%,其中母猪血清学样品阳性率54.2%、90.0%,仔猪血清学样品阳性率33.3%、74.2%。规模猪场两种病的混感率由2013年的29.4%上升到2014年的42.4%。规模猪场在净化伪狂犬病野毒的同时,要做好猪圆环病毒2型的免疫,才能取得比较理想的防治效果,提高猪场的经济效益。     

产气荚膜梭菌ε毒素研究进展

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患细菌性传染病病原,在自然界中分布极广,一定条件下可引起多种疾病.该菌常通过其外毒素危害人和动物机体,所产毒素主要有α、β、ε和ι4种外毒素.根据毒素产生的情况,将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E、F和G7个型.ε毒素毒力最强,主要由B型和D型菌分泌.论文通过致病机理、病理变化、流行特点...     

表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建

【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa^[1]。将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF（moi=0.01）,每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221）,观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196-723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为10^6.2TCID₅₀/0.1mL、10^5.5TCID₅₀/0.1mL,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1-5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15-20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以10^3.0TCID₅₀/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性,为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。     

盐酸克伦特罗检测方法的比较和应用

综述了目前盐酸克伦特罗(瘦肉精)的检测方法,对各种检测方法进行了比较,以及分析了各种检测方法的应用。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行分析与鉴定。用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白作为免疫原免疫8周龄的Balb/c小鼠,无菌取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀后,收集腹水,纯化后进行单克隆抗体浓度、纯度、类及亚类、抗体效价、相对亲和常数、Western blot和间接免疫荧光测定。结果表明,筛选到2株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4G3D4和9D7A7。4G3D4和9D7A7这2株单抗纯化后的浓度分别为2.6 mg/mL、1.6 mg/mL;亲和常数分别为2.30E+10、1.88E+09;抗体亚类均为IgG1,轻链为kappa链;且均能与IBRV发生特异性反应,与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光;间接ELISA测定腹水效价分别为1∶204800、1∶12800。利用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白成功制备了2株单克隆抗体,为下一步建立特异性的IBRV检测方法奠定了基础。     

ELISA法检测种蛋卵黄中禽网状内皮组织增生症病毒抗体的研究

为研究种蛋卵黄中禽网状内皮组织增生症病毒(REV)抗体的检测方法,运用IDEXX公司的REV抗体ELISA检测试剂盒,比较了不同提取方法、不同稀释倍数、不同洗液对卵黄中REV抗体检测结果的影响。结果显示:当用直接提取的卵黄液做300倍稀释检测,用含0.05%吐温-20的蒸馏水洗涤时,卵黄抗体的S/P比值与相应鸡群的血清抗体的S/P比值吻合度最高。应用本方法分别对50枚SPF种蛋和50枚普通鸡蛋进行检测,SPF种蛋均为REV抗体阴性;普通鸡蛋有4枚为REV抗体阳性,阳性率为8%。实验表明,种蛋卵黄ELISA抗体检测法可以代替传统血清抗体检测,为SPF鸡群的REV感染监测奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒和A亚群禽白血病病毒共感染对疫苗免疫鸡生长性能和免疫器官的影响

禽为分析不同免疫状态下禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus, REV)和A亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus, ALV-A)共感染对鸡生长性能及免疫器官的影响,通过对 1日龄和 10日龄常规疫苗免疫鸡群、1日龄灭活疫苗免疫鸡群、1日龄活疫苗免疫鸡群进行REV与ALV-A单感染或共感染,于不同日龄称重,采集免疫器官,对生长性能、免疫器官比重进行比较和分析。结果显示,1日龄鸡单感染或共感染REV和ALV-A均会引起发病、死亡及体重下降,REV、ALV-A单感染组及共感染组平均病死率依次为27.6%、11.6%及31.9%,表明,疫苗免疫刺激增强了REV与ALV-A感染的致病性。10日龄鸡REV、ALV-A单感染及共感染于81日内病死率分别为13.3%、6.7%及20%,低于1日龄感染各相应组,体重下降程度也低于 1日龄感染鸡,表明鸡的日龄越高对REV、ALV-A感染的抵抗力越强。活疫苗与灭活疫苗免疫的比较显示,两种疫苗免疫应激均能引起鸡体重下降明显,且活疫苗免疫对体重的抑制作用更明显。REV单感染和共感染对生长发育的抑制作用高于ALV-A单感染,尤其是共感染对鸡体重的抑制作用最明显。对免疫器官比重的影响方面,1日龄感染时,共感染组胸腺比重显著降低,10日龄感染影响不显著,表明鸡日龄越大对病毒感染的抵抗力越强;常规免疫可引起法氏囊比重下降,但对法氏囊的影响是可恢复的,而REV单感染和共感染会加重常规免疫对法氏囊的损伤,且损伤更持久或不可恢复;ALV-A单感染对法氏囊的损伤影响不明显;单感染和共感染对脾脏比重的影响均不显著。本研究为深入研究REV和ALV-A单感染或者共感染诱导鸡群发生免疫抑制机制积累了重要的实验数据。     

抗鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其应用研究

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的VP2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗VP2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交瘤细胞Mab-VP2-4株,制备的小鼠腹水效价达到1∶2000。结果显示,制备的抗VP2蛋白单克隆抗体可与多株CIAV感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应,而对EDSV、ALV、ILTV、ARV以及空白MDCC-MSB1细胞、CEF细胞等均无交叉反应,特异性良好,且应用于IFA方法时对CIAV感染的最低检出限为5 TCID50。以该单克隆抗体对市场上10种不同来源的禽活疫苗进行病毒分离结合单克隆抗体IFA检测,同时与《中国兽药典》规定的鸡检查法进行对比检测,结果一致,均未检出CIAV污染。本研究制备了针对CIAV VP2蛋白的特异性单克隆抗体,为该病特异性诊断方法的建立奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法,利用大肠杆菌表达系统成功表达E2蛋白并纯化,利用纯化后的蛋白作为包被抗原,用方阵法对影响ELISA试验的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。确定E2抗原最佳包被浓度为1μg/mL,最佳血清稀释度为1∶40,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min;最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD_450nm≥0.255。与血清中和试验和商品化试剂盒进行比较,总符合率分别为98%和96%,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与其它常见牛病毒阳性血清均无交叉反应。本研究成功建立了间接ELISA方法,为进一步用于大批量牛血清样本的抗体检测和流行病学研究奠定了基础。