CaMV35S启动子及其在转基因作物中的应用和检测

花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)是植物基因工程中应用最广泛的启动子之一,它在转基因植物的安全评价及检测研究中具有重要意义。了解CaMV35S启动子的起源及其发展情况,是开展转基因安全评价和检测的前提。文章对CaMV35S启动子的发展历史及其结构、功能作了简要描述,分析总结了CaMV35S启动子在转基因作物中的应用情况和目前对其相应的检测方法。针对目前在转基因作物中检测CaMV35S启动子存在的问题,认为今后转基因相关作物的序列信息及检测数据需要交流和共享,同时各个检测机构或实验室之间需要展开数据共享与共同验证,从而建立针对CaMV35S启动子的相对统一的标准检测方法。     

贝母属植物叶绿体基因组候选SNP位点应用分析

贝母属植物是中国中药材的宝库,由于形态上难以区分,在民间应用、临床应用和中药市场中还存在混淆应用、以次充好的现象,急需开发基于新型分子标记位点的精准检测方法。本研究应用多重序列比对、SNP筛选等生物信息学分析手段,对贝母属15种植物28条叶绿体基因组序列进行分析。结果发现,贝母属叶绿体基因组DNA同源性达97.22%,通过分析共发现SNP位点5879个,其中川贝母类鉴别候选位点71个,川贝母鉴别候选位点4个,瓦布贝母鉴别候选位点37个,太白贝母鉴别候选位点147个,浙贝母鉴别候选位点91个,湖北贝母鉴别候选位点271个,平贝母鉴别候选位点1393个,伊贝母鉴别候选位点89个。本研究还对SNP位点在精准鉴定、精确定量应用方面进行了讨论,可为川贝母中药资源鉴定提供技术支撑。     

连续低剂量黄曲霉毒素B1对大鼠肝肾损伤作用

用含有不同质量浓度黄曲霉素B1（AFB1）（0、4、20、25、50μg／kg）的污染饲料连续饲喂各试验组大鼠60d,于7、15、30、60d静脉取血,测定各组大鼠肝功能与肾功能生化指标。每周检测大鼠体质量,试验第60天断头处死大鼠,检测肝肾组织病理学变化并计算各组大鼠的脏体系数。试验期间备组受试动物未发现明显的中毒症状和异常情况,60d内无受试动物死亡。与对照相比,不同剂量组AFB1对大鼠体质量无显著性影响;连续喂饲7d,大鼠血清AST和BuN含量显著升高（P〈0．05）;连续喂饲15d,大鼠血清AsT、BUN和ALB含量显著升高（P〈0．05）,连续喂饲30d,大鼠血清BUN含量显著升高（P〈0．05）,连续喂饲60d,大鼠血清CR和BUN含量显著升高（P〈0．05）。在各测试质量浓度条件下,大鼠虽未发现明显的中毒症状和异常情况,试验期间无动物死亡,但与空白对照相比,各剂量组AFBl对大鼠均产生了显著的肝肾组织病理学损伤,中毒程度与给毒剂量成正相关性。随着毒素暴露时间延长,大鼠肝脏对低剂量AFBl表现出一定的耐受性,而大鼠的肾脏损伤与毒素暴露时间表现出显著的积累效应。     

转Bt基因对水稻内生原核微生物定殖数量效应分析

为探讨转Bt基因对水稻内生原核微生物定殖的数量效应,首先确定水稻根、茎、叶表面微生物的消毒时间和条件;其次,在有效排除水稻植株表面微生物干扰的条件下,应用纯培养方法对转Bt基因及其亲本水稻各组织的内生原核微生物定殖数量进行检测分析,初步评估各亲本水稻在引入外源Bt基因后,给水稻植株内生原核微生物数量带来的影响。结果显示,水稻根际微生物以70%乙醇浸泡7 min,茎和叶表面微生物以70%乙醇浸泡2 min,以无菌水漂洗2次,可达到杀灭表面微生物的效果。本次试验中,ZJ-22和明恢63两个水稻品系亲本植株根、茎的内生原核微生物定殖数量,在苗期和分蘖期时均高于对应的转Bt基因植株(ZJ-22Bt和TT51-1);苗期时两个品系亲本水稻叶片内生微生物数量同样高于转Bt基因水稻,分裂期转Bt水稻TT51-1叶片内生原核微生物数量则多于其亲本植株明恢63。以上结果表明,两个品系亲本水稻插入外源基因后,在苗期和分裂期对亲本植株各部位的内生原核微生物定殖情况均产生了一定的影响。     

转基因大豆SHZD32-1转化体普通PCR和qRT-PCR检测方法的研究

转基因大豆(Glycine max)SHZD32-1是我国自主研发的耐除草剂大豆转基因品系,该材料将耐草甘膦基因G10-EPSPS导入栽培品种中豆32(Glycine Max,Zhongdou 32)使其获得耐除草剂抗性,具有广阔的应用前景。到目前为止,尚没有针对SHZD32-1的检测方法系统研究的报道。本研究以转基因大豆SHZD32-1转化体的插入位点基因组序列和外源插入片段/基因组连接区序列为靶标,通过设计和筛选引物、探针,特异性、灵敏度等测试,建立了特异性SHZD32-1转化体普通PCR和q RT-PCR检测方法。检测方法特异性实验中,普通PCR和q RT-PCR方法均只在含有SHZD32-1的样品中扩增出阳性结果,而其他不含有SHZD32-1的检测样品中均为阴性结果;方法灵敏性检测中,普通PCR检测法检出限为0.1%,q RTPCR法检测下限(limit of detection,LOD)为21个拷贝;方法稳定性实验中,普通PCR和q RT-PCR方法在其相应最低检出限浓度下进行60次重复试验,结果均为阳性。本研究建立的SHZD32-1转化体特异性PCR检测方法特异性好、灵敏度高、稳定性强。转基因作物转化体特异性检测方法的研究是转基因生物分子特征评价的重要内容之一,其为转基因生物安全监管和追溯提供了技术支持。     

环介导等温扩增终端产物检测及结果判断的研究进展

摘要：环介导等温扩增（LAMP）技术在2000年被日本学者Notomi 等提出,并用琼脂糖凝胶电泳及SYBR GreenⅠ荧光定量的方法对其产物、扩增灵敏度进行了分析。为了使LAMP终产物检测更加简单、直观、省时,国内外科学家进行了大量的研究,先后提出浊度分析法、HNB指示剂、蜡丸染料等简便易操作的LAMP终产物检测及结果判断方法,目前应用较多的是琼脂糖凝胶电泳、浊度分析法、HNB指示剂法与SYBR GreenⅠ指示剂法。本文就近年来LAMP终产物检测及结果判断进行了综述,汇总了近年来LAMP终产物检测方法,以期为未来LAMP终产物检测方法的发展提供新的思路。     

昆虫抗白僵菌免疫应答及其在害虫防治中的应用潜力

昆虫病原真菌白僵菌能成功侵染多种昆虫寄主并致其死亡,是农业生产中有效的生物杀虫剂。相应地,昆虫依赖多种策略抵御真菌感染,其中先天免疫防御是对抗真菌感染的重要手段。昆虫表皮是抵御真菌入侵的第一道屏障,表皮和外分泌腺可分泌多种抑菌化合物降低真菌毒力,当真菌孢子进入血淋巴后,细胞免疫和体液免疫共同作用产生系统性免疫应答,表达的多种防御效应因子在细胞包囊、细胞凋亡、黑化反应中发挥功能。然而昆虫强烈的免疫反应影响田间施用白僵菌的效果,导致该真菌制剂应用的局限性。文章详细阐述昆虫感染白僵菌后的免疫应答机制,参与抗真菌免疫的基因与作用手段。该研究为了解昆虫抗真菌免疫机制提供了详实的基础,为合理改造白僵菌、有效提高白僵菌毒力水平提供坚实基础,为农业虫害治理提供新的策略。     

西瓜细菌性果斑病菌现场快速双模荧光RPA检测方法的建立

瓜类细菌性果斑病菌(bacrerial fruit of blotch,BFB)是中国检疫性病害,其传播非常迅猛,且目前没有商品化抗病品种。为建立西瓜果斑病菌现场快速荧光重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法,针对细菌性果斑病菌特异性序列设计并筛选出了RPA最佳的引物和探针组合,利用两种模式[实时荧光监测RPA(real time RPA,RT-RPA)和终端荧光可视化检测RPA(end point RPA,EP-RPA)]对RPA的结果进行分析,并与实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果进行对比。结果显示,建立的细菌性果斑病菌双模荧光RPA检测方法特异性强,且其对病原物的检测灵敏度与qRT-PCR的灵敏度相当。在实际样品检测中,RT-RPA、EP-RPA和RT-PCR的检测结果一致性为100%。在检测时间上,EP-RPA的检测时间为20 min,RT-RPA平均检测时间约为5 min,qRT-PCR的平均检测时间约为44 min;RPA的检测速度最快,而且不依赖大型的仪器,方便快捷,适用于现场检测。该恒温快速检测方法的建立为植物病害的现场检测提供了新的技术支持。     

金属络合剂酸性络蓝K在TNOS-LAMP可视化检测体系中的应用

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种快速、灵敏度高和特异性强的等温核酸扩增技术,已被广泛用于各领域.与此同时,高灵敏度也使得扩增时极易出现交叉污染,而利用闭管检测技术能有效降低其污染机率.本研究引入了一种新型的金属指示剂-酸性络蓝K (acid chrome blueK,ACBK),建立了闭管LAMP扩增和检测结果可视化检测技术.首先,本研究分别在LAMP 扩增的起始体系中,先后分别测试ACBK与缓冲液、dNTPs、引物和Mg2+等组分反应,确定了含有ACBK的LAMP体系中的颜色变化由Mg2+决定,化学方法也进一步验证了这一结论.随后,对LAMP检测体系中的ACBK指示剂的浓度及Mg2+的浓度进行了选择和优化,最终选定25 μL扩增体系中ACBK的检测浓度为:2 μL 0.04％ ACBK,Mg2+浓度为:6 mmol/L.以胭脂碱合成酶基因终止子(terminator of nopaline synthase gene,TNOS)为靶基因,建立了TNOS-ACBK-LAMP检测体系.建立的体系的检测灵敏度针对转基因水稻的检测限为100拷贝,在分别含有50 ng的水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、油菜(Brassica napus)和玉米(Zea mays)基因组中能检测出0.1％的转基因含量.同时,利用不同转化事件及不同作物的转基因材料验证了其检测特异性,结果表明,构建的TNOS-ACBK-LAMP的检测系统具有很强的检测特异性.最终,将该检测体系成功用于对实际玉米样品转基因成分的检测,检测结果既可以裸眼直接判断也可以借助紫外可见光谱分析.该方法的建立为可以加快转基因成分检测的速度,同时也为等温扩增方法的判断提供了新的思路.     

铁皮石斛鉴定方法与技术的研究进展

铁皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物,具有滋阴除热、 生津养胃等功效.目前铁皮石斛市场上存在严重的掺假造假现象,迫切需要进一步发展铁皮石斛的鉴定方法和技术.本文对铁皮石斛现有的组织形态、显微鉴定、 理化分析鉴定和DNA分子生物学鉴定等主要方法和技术进行阐述,介绍了各鉴定方法和技术的发展历程及最新进展,着重分析了基于理化性...