中国对虾SRAP分子标记体系正交优化及在遗传多样性分析中的应用

利用正交设计L16(45)对影响中国对虾SRAP分子标记分析的5个因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTP和引物浓度)在4个水平上进行了优化,筛选出各反应因素的最佳水平为:20μl反应体系中包含1.0UTaq酶,2.0mmol/L的Mg2+,40.0ng的模板DNA,0.125mmol/L的dNTP以及0.4μmol/L的引物,退火温度为53.5℃。研究表明,各因素的不同水平对扩增结果有显著影响,其中Mg2+影响最大,影响大小顺序依次为Mg2+,Taq酶,引物,dNTP和模板DNA。利用优化的SRAP分子标记体系对中国对虾"黄海1号"第12世代选育群体进行了遗传多样性分析,实验结果表明,此标记技术可作为中国对虾遗传分析的良好技术工具。遗传多样性分析共筛选出8对可以扩增出清晰稳定条带的引物组合,共获得171个位点,其中多态性位点154个,占90.08%;有效等位基因数为1.7741,期望杂合度均值为0.4219,Shannon多样性指数为0.6055。上述参数值均高于应用AFLP技术对前几代选育群体的遗传多样性分析结果。     

强壮藻钩虾对中国明对虾与日本囊对虾生长和抗病力的影响

以强壮藻钩虾(以下简称钩虾)作为中国明对虾和日本囊对虾的天然饵料,以对虾人工配合饲料为对照研究钩虾对中国明对虾和日本囊对虾生长和抗病力的影响。对两种规格的中国明对虾[体质量分别为(0.33±0.0204)g和(2.07±0.184)g,分别记为SF组和MF组]和日本囊对虾[体质量为(0.25±0.018 1)g,记为SM组]分别投喂人工配合饲料和钩虾,养殖35 d。结果显示:(1)与人工配合饲料相比钩虾可以提高MF组和SM组对虾的特定生长率和SM组对虾的成活率;(2)钩虾可以显著提高SF组和SM组对虾血细胞总数(P<0.05);(3)钩虾可以显著提高3组对虾血清总蛋白含量(P<0.05)及SF组和SM组血蓝蛋白含量(P<0.05);(4)钩虾可以显著提高日本囊对虾溶菌酶活力(P<0.05);(5)钩虾可以显著提高FM组和SM组对虾酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力(P<0.05);(6)钩虾可以显著性提高SF组和SM组对虾血清过氧化物酶相对活力(P<0.05);(7)对虾健康指标总得分与其感染WSSV后的100%致死时间关系密切,两者之间呈现一定的线性关系(R2=0.948 9)。研究结果表明,钩虾与对虾人工配合饲料相比可以促进中国明对虾和日本囊对虾的生长及提高对虾抗病力。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda) 2-巨球蛋白cDNA全长的克隆和表达分析

根据本实验室前期获得的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda) α2-巨球蛋白基因EST序列,采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA end, RACE)技术克隆获得脊尾白虾α2-巨球蛋白基因cDNA全长,命名为Ecα2M基因。该基因全长4823 bp,由4413 bp的开放阅读框、64 bp的5?端非编码区以及346 bp的3?端非编码区组成。开放阅读框编码1470个氨基酸,分子量为163.0 kDa,理论等电点为5.03。序列分析显示,Ecα2M序列N端含有23个氨基酸组成的信号肽。同源性分析显示,脊尾白虾Ecα2M氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii) α2M的同源性最高,达到80%。荧光定量PCR分析结果显示,Ecα2M基因在血细胞、肝胰腺、肌肉、鳃、卵巢、眼柄、胃及肠中均有表达,其中在血细胞中的相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后,脊尾白虾血细胞中Ecα2M的相对表达量于6 h达到最大值且显著高于对照组(P<0.05),肝胰腺中Ecα2M的相对表达量于3 h达到最大值且显著高于对照组(P<0.05),相对表达量变化具有明显的时间差异性。     

脊尾白虾14-3-3 基因cDNA 全长的克隆和表达分析

利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞cDNA文库中脊尾白虾14-3-3巨球蛋白基因EST序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆获得脊尾白虾14-3-3基因c DNA全长,命名为Ec14-3-3。该基因全长2905 bp,包含744 bp的开放阅读框,编码247个氨基酸组成的蛋白质,分子量为27.95 kD,理论等电点为4.65。同源性分析表明,脊尾白虾Ec14-3-3氨基酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)14-3-3的同源性最高,达到98%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec14-3-3基因在血细胞、卵巢、肝胰腺等组织中均有表达,其中血细胞中Ec14-3-3相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后6 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec14-3-3基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究结果表明,Ec14-3-3基因在脊尾白虾免疫反应中发挥重要作用。     

中华虎头蟹线粒体16S rRNA和 COⅠ基因的序列比较及其系统进化分析

为研究中华虎头蟹野生群体的种质资源及遗传多样性状况,采用PCR扩增获得中华虎头蟹线粒体DNA的16S rRNA和COⅠ基因片段,分别对其进行序列比较及系统进化分析。16S rRNA和COⅠ基因片段的A+T平均含量分别为67.7%和61.4%,A+T含量显著高于G+C含量。长度为515 bp的16S rRNA基因片段共检测出单倍型4种,多态性位点4个,均为单一变异位点;长度为653 bp的COⅠ基因片段共检测出单倍型11种,多态性位点23个,其中简约信息位点5个和单一变异位点18个。COⅠ基因片段比16S rRNA基因片段具有较大的变异,更适于中华虎头蟹种群的遗传多样性分析。基于16S rRNA和COⅠ基因片段的遗传距离与系统进化分析结果一致,表明中华虎头蟹与梭子蟹科的蟹类亲缘关系最近,方蟹科与沙蟹科的蟹类聚为一支,与传统分类结果基本一致;而脊椎动物2个基因片段的系统进化分析结果不一致。根据16S rRNA基因片段的遗传距离推测出4科7种蟹的大致分化时间发生在古新世至始新世。     

[18]中国明对虾“黄海 1 号”血细胞和肌肉 cDNA 文库的构建

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氟苯尼考对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)免疫和抗氧化功能的影响

为研究氟苯尼考对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)免疫和抗氧化功能的影响,以低、中、高(10、20和40 mg/kg·BW)3种剂量氟苯尼考药饵连续投喂脊尾白虾5d,对照组投喂基础饲料.于停止投喂药饵后的第3、6、12、24、48、96、168和240 h取血淋巴,测定血蓝蛋白(HEM)含量、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和总抗氧化能力(T-AOC)等指标的变化情况.结果显示,低、中剂量组HEM含量均在3h时间点显著高于对照组(P＜0.05),高剂量组在3-48 h显著高于对照组(P＜0.05);低、中剂量组ACP活性在3h和6h显著高于对照组(P＜0.05),高剂量组在3-168 h显著低于其他3组(P＜0.05);低、中剂量组AKP活性在3h均显著高于对照组(P＜0.05),6-48 h显著低于对照组(P＜0.05),高剂量组在3-48 h显著低于对照组(P＜0.05);低、中剂量组T-SOD活性整体高于对照组,分别在6h和24 h达到最高值(P＜0.05),高剂量组在24 h和48 h显著低于对照组(P＜0.05);低、中、高剂量组CAT活性均在3h和6h显著高于对照组(P＜0.05),之后在12-96 h显著低于对照组(P＜0.05),于24 h达到最低值(P＜0.05);低、中、高剂量组T-AOC活性均在3-96 h显著低于对照组(P＜0.05),于48 h达到最低值(P＜0.05),且出现剂量效应.本研究结果为氟苯尼考在海水养殖生产中使用的安全评估提供了数据支持.     

渔业可持续发展要两手抓

池塘养殖是我国海水养殖的传统方式,也是当前陆基海水养殖的主体。自20世纪70年代,海水池塘养殖经历了粗放式、半集约、集约化和多营养层次生态养殖的发展历程。然而,海水池塘养殖产业中仍存在养殖生物生态适应性机制不清、养殖系统产出不稳定、营养物质利用效率低等“瓶颈”问题,严重制约了海水池塘养殖产业的发展。因此开展海水养殖虾蟹良种与生态环境的互作机制解析,研发养殖生态系统结构优化和营养物质资源化高效利用技术,搭建养殖信息采集与智能化管控平台,创建生态工程化养殖新模式,实现养殖系统高效可持续产出,是我国海水池塘养殖产业绿色高质量发展的关键。

     

氨氮胁迫对中国明对虾血淋巴氨氮、尿素氮含量和抗氧化能力的影响

将600尾体重为(5.0±1.2)g的健康中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)随机分为5组,每组6个重复,每个重复20尾虾,分别暴露于不同氨氮质量浓度(0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L和8 mg/L)海水中,于胁迫后6 h、24 h、48 h、72 h和96 h测定血淋巴氨氮、尿素氮含量、总抗氧化能力(T-AOC)、抗超氧阴离子活力和血淋巴细胞过氧化氢酶(CAT)基因、过氧化物还原酶(Prx)基因和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)基因的相对表达量,以0 mg/L氨氮组作为对照。结果显示,随着氨氮胁迫时间的延长,中国明对虾血淋巴氨氮含量逐渐积累,以8 mg/L组对虾血淋巴氨氮含量最高,是对照组的5.85倍。氨氮胁迫6 h,胁迫组中国明对虾血淋巴尿素氮含量显著高于对照组(P0.05),其中6 mg/L组对虾血淋巴尿素氮含量最高,是对照组的2.22倍。氨氮胁迫下中国明对虾血淋巴T-AOC、Prx mRNA相对表达量随着取样时间推移先升高后降低,而血淋巴抗超氧阴离子活力、CAT和caspase mRNA相对表达量随时间增加呈现先上升后下降再上升的变化过程。氨氮胁迫下中国明对虾血淋巴抗氧化能力被显著诱导,这可能破坏机体的氧化-抗氧化系统的平衡,从而导致caspase mRNA相对表达量的上调。     

塔玛亚历山大藻毒素及其对中国对虾的急性毒性

利用美国分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists, AOAC)所推荐的小鼠生物法(mouse bioassay, MBA), 测定了塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)(ATHK藻株)毒素粗提液的麻痹性贝毒(paralytic shellfish poisoning, PSP)毒性;采用浸浴方式, 研究了该藻株对中国对虾的急性毒性; 采用HE染色方法, 分别对有毒藻浸浴处理和毒素粗提液注射处理后96 h中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)的鳃和肝胰腺石蜡切片进行观察。结果表明, 该藻株麻痹性贝毒毒性为3.9×10^–5 MU/cell (相当于7.3 pg STX Equal/cell), 在同种藻株中属低毒藻株; 在96 h急性毒性实验中, 塔玛亚历山大藻对中国对虾的半致死浓度(LC₅₀)为1.0×10⁴ cells/mL, 安全浓度(SC)为1.0×10³ cells/mL; 石蜡切片观察发现, 塔玛亚历山大藻与毒素粗提液分别引起了鳃和肝胰腺组织出现细胞肿胀、空泡化等病理变化。以上研究结果提示, 塔玛亚历山大藻对中国对虾有急性致死作用。为了保证中国对虾的健康养殖, 养殖水体中的塔玛亚历山大藻浓度至少应该控制在1.0×10³ cells/mL以下; 鳃的病变直接导致对虾窒息死亡可能是塔玛亚历山大藻暴露后对虾急性致死作用的最重要原因;塔玛亚历山大藻所产的PSP毒素可引起虾体代谢和解毒的主要器官—肝胰腺的病变。