牙鲆早期发育和变态期间Pitx2基因的表达(英文)

Pitx2基因被认为是脊椎动物中调节内脏器官左右不对称的关键转录因子。为进一步探讨牙鲆变态期间的左右不对称是否也受Pitx2的左特异活性调节,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),拟在变态的牙鲆的头部组织中克隆编码Pitx2基因的部分cDNA序列,并通过以18s rRNA为内标的半定量RT-PCR研究其在牙鲆早期发育和变态期间的表达情况。克隆和测序的结果表明Pitx2在牙鲆早期发育和变态期间也存在基因表达;而半定量的结果表明它的左特异性功能很可能在变态的早期阶段发挥作用。但是,牙鲆变态期间的右眼移动是否受Pitx2的左特异活性调控,以及变态期间的左右不对称和内脏器官的左右不对称是否拥有相同的分子机制,仍需进一步研究。     

“全红”和“粉玉”瓯江彩鲤体表组织中差异色素的鉴定

为了解"全红"和"粉玉"瓯江彩鲤(Cyprinus carpio var.color)体表组织中的差异色素,分别采用分光光度法和高效液相色谱方法对两种体色瓯江彩鲤的皮肤、鳍条和眼睛中的差异色素进行鉴定。分光光度法测定结果表明:"全红"皮肤中类胡萝卜素含量显著高于"粉玉"皮肤(P0.05),而蝶啶色素不存在显著性差异(P0.05)。随后通过高效液相色谱法对这两种体色的皮肤、眼睛和鳍条中类胡萝卜素的种类和含量进行鉴定,发现"全红"的皮肤、眼睛和鳍条中含有大量的以酯化形式存在的虾青素和黄体素,以及部分未知的类胡萝卜素,而"粉玉"的这些组织中检测不到虾青素和黄体素等类胡萝卜素。"全红"鳍条中虾青素含量最高为(28.00±3.61)mg/kg,而皮肤中的黄体素含量最高为(62.34±4.93)mg/kg。研究表明:虾青素和黄体素等类胡萝卜素是瓯江彩鲤红色体色的关键色素,蝶啶色素对红色没有作用,瓯江彩鲤白色体色存在类胡萝卜素的缺失现象。     

牙鲆let-7基因的克隆与表达及其靶基因预测

let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变过程中起着极其重要的作用.为探讨let-7对牙鲆(Paralichthys olivaceus)从幼体到成体转变的变态发育过程的影响,本实验对let-7进行了克隆与表达研究,并预测了其可能的靶基因.利用普通PCR技术从牙鲆中成功鉴定出let-7及其前体序列,...     

IGF-Ⅰ及其受体基因在牙鲆胚胎发育过程中的表达图式

胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor Ⅰ,IGF-Ⅰ)是脊椎动物生长发育的重要调控因子,其生物学功能主要通过与其特异的膜受体(IGF-Ⅰ receptor,IGF-IR)结合而调节.因此,IGF-Ⅰ及其受体表达特征的分析对于阐述IGF系统调控的发育过程具有重要的意义.本研究采用荧光实时PCR方法,以不同发育时期的牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎为材料,分析了胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)及其两种受体基因在鱼类胚胎发育过程中的表达图式.结果显示,牙鲆IGF-Ⅰ、IGF-IR-1和IGF-IR-2基因均有母源转录本,且各基因的表达在胚胎发育的不同阶段具有明显的发育性变化.IGF-Ⅰ基因在早期胚胎发育阶段仅有少量的mRNA存在,而合子基因的表达在晶体出现至出膜前阶段逐步增加.两种IGF-Ⅰ受体基因则展现出迥然不同的表达时序.IGF-IR-1基因在受精卵、卵裂及囊胚期的早期胚胎发育中有相对较少的转录本,至原肠期其合子基因强烈表达,且在神经胚、晶体出现、心跳和出膜前各阶段均有高量的表达;相反,IGF-IR-2基因在受精卵至原肠期的早期胚胎中有丰富的转录本,但合子基因的表达在后期胚胎形成中却相对降低,暗示了二者可能在调节牙鲆胚胎发育中起着不同的作用.     

牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的功能分析及甲状腺激素对其调节作用

为分析牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区和第一内含子调控序列的功能,本研究运用DNA重组技术将PCR扩增得到的牙鲆碱性磷酸酶基因的5′调控区序列、第一内含子序列及5′调控区和第一内含子串联序列分别插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pAcGFP1-1中,得到pAcGFP1-5′ALP、pAcGFP1-Intron1和pAcGFP1-AI报告基因表达载体。通过脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并检测荧光信号。转染后细胞状态良好,24 h后发现,在倒置荧光显微镜下均可看到不同强度的绿色荧光信号,且荧光信号随时间的延长而增强,其中转染pAcGFP1-AI后的荧光信号强度最强。以上结果表明,牙鲆碱性磷酸酶基因5′调控区和第一个内含子序列均具有启动子活性,且第一内含子与5′调控区存在协同效应,两者协同能增强基因的表达。为了解甲状腺激素T3对调控序列启动子活性的调节作用,用不同浓度的T3处理转染的CHO细胞,24 h后发现加入50、75和100 nM的T3都增强了绿色荧光蛋白的表达,而且信号强度随T3浓度的增加而增强。这表明甲状腺激素T3对牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的启动子活性有一定的增强作用。本研究为深入阐明牙鲆碱性磷酸酶基因转录表达的分子机制提供了实验依据。     

IGF-I及其受体基因在牙鲆胚胎发育过程中的表达图式

胰岛素样生长因子-I(insulin-like growth factor I, IGF-I)是脊椎动物生长发育的重要调控因子, 其生物学功能主要通过与其特异的膜受体(IGF-I receptor, IGF-IR)结合而调节。因此, IGF-I及其受体表达特征的分析对于阐述IGF系统调控的发育过程具有重要的意义。本研究采用荧光实时PCR方法, 以不同发育时期的牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎为材料, 分析了胰岛素样生长因子-I(IGF-I)及其两种受体基因在鱼类胚胎发育过程中的表达图式。结果显示, 牙鲆IGF-I、IGF-IR-1和IGF-IR-2基因均有母源转录本, 且各基因的表达在胚胎发育的不同阶段具有明显的发育性变化。IGF-I 基因在早期胚胎发育阶段仅有少量的mRNA存在, 而合子基因的表达在晶体出现至出膜前阶段逐步增加。两种IGF-I 受体基因则展现出迥然不同的表达时序。IGF-IR-1 基因在受精卵、卵裂及囊胚期的早期胚胎发育中有相对较少的转录本, 至原肠期其合子基因强烈表达, 且在神经胚、晶体出现、心跳和出膜前各阶段均有高量的表达; 相反, IGF-IR-2 基因在受精卵至原肠期的早期胚胎中有丰富的转录本, 但合子基因的表达在后期胚胎形成中却相对降低, 暗示了二者可能在调节牙鲆胚胎发育中起着不同的作用。

     

miR-124和Otx2在牙鲆变态发育期间的表达调控及其靶向关系验证

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是研究鱼类变态发育的理想模型,其右眼移位及生活习性的改变受甲状腺激素(TH)调控。同时microRNA (miRNAs)在变态期间发挥关键性作用。为研究TH、pol-miR-124及Otx2在牙鲆变态中的调控机制,本实验通过生物信息学方法预测pol-miR-124潜在靶基因Otx2,首先利用qRT-PCR检测在牙鲆各组织、正常变态及外源TH处理仔鱼后pol-miR-124和Otx2的表达模式。然后克隆400 bp含有“种子序列”的Otx2 3′UTR区序列,构建野生型重组载体pmirGLO-Otx2并转染293T细胞检测双荧光素酶活性确定靶向关系。qRT-PCR结果表明: pol-miR-124和Otx2均在脑和眼睛组织中特异性高表达;在仔鱼变态28 dph表达量最高与变态进程相一致;TH作用下,在20 dph、24 dph时期, pol-miR-124的表达量低于正常组,而Otx2的表达量高于正常组;在28 dph、32 dph、36 dph时期, pol-miR-124的表达量高于正常组,但Otx2的表达量低于正常组,两者呈现出相反的表达趋势;双荧光素酶结果显示pol-miR-124靶向负调控Otx2。本实验旨为揭示牙鲆视觉感光系统的发育机制奠定研究基础,同时为探讨牙鲆变态发育机制提供了新的理论依据。     

褐牙鲆变态期间骨骼发育及其相关基因Sox9,Bmp4和Bmp2的表达分析

褐牙鲆作为一种重要的经济鱼种,有一个特殊的变态发育时期,其间骨骼形态和位置都发生很大改变。本研究利用三重染色技术,对褐牙鲆变态发育时期不同阶段的仔鱼整体骨骼进行染色,并对各阶段仔鱼及部分成鱼组织,采用特异性引物对骨骼发育的相关基因Bmp2,Bmp4和Sox9基因片段进行了克隆和半定量分析。研究表明,随着仔鱼变态发育,部分软骨逐渐转化为硬骨,头部筛骨呈不对称分化,额骨和顶骨位置发生改变,口形态改变,鳃丝软骨成骨,脊椎逐渐发育成熟,随之侧线位置发生改变。Sox9以及Bmp2、Bmp4基因在这时期中存在着差异表达,对骨骼发育有一定的调控作用。成鱼中,Bmp2和Sox9只在鳃、肠道和肝脏中有表达,且鳃中表达量较高。Sox9出膜后表达量突然增加,头部表达量较高,变态发育中开始递减,在变态高峰期明显减少;而Bmp4表达量则是出膜后明显减少,随后在变态高峰期表达量有增加,总体趋势表达量减少。     

应用激光共聚焦显微技术研究Ca2+在三角帆蚌组织内的积累与分布

为了探讨淡水贝类Ca2+吸收和转运信号传递机理,采用激光共聚焦技术研究了三角帆蚌不同组织细胞在静息状态下细胞内游离Ca2+浓度,以及水体Ca2+浓度对外套膜组织细胞内钙沉积的影响。试验选取10只健康的三角帆蚌,分别获得外套膜外膜、内膜、斧足、腮及内脏团上表皮组织细胞,短期培养后用Fluo-3/AM荧光探针孵育细胞1 h,观察细胞内Ca2+荧光强度。研究结果表明,蚌不同组织细胞内Ca2+荧光强度存在显著差异,外套膜外膜细胞内Ca2+荧光强度最高,内脏团上表皮细胞的最低(P<0.05);育珠三角帆蚌在相同Ca2+浓度的孵育水平下,外套膜细胞内Ca2+荧光强度比非育珠蚌都有增加的趋势,其中在1.25 mmol/L添加组中,两组外套膜内膜细胞内Ca2+荧光强度差异达到显著水平(P<0.05);不同Ca2+孵育水平对细胞内Ca2+荧光强度有显著影响(P<0.05),随着Ca2+在孵育液中浓度的升高,外套膜细胞内Ca2+荧光强度显著增强(P<0.05),表明外套膜是从外界吸收Ca2+的主要组织,蚌体珍珠的培育增强了其对Ca2+的沉积,并且水体Ca2+浓度在1.25～3.00 mmol/L有助于蚌体内Ca2+的贮藏,这对进...     

牙鲆变态中两种HSP90基因的不同表达及其与甲状腺激素的关系

热休克蛋白90(heat shock protein90,HSP90)是细胞内主要的伴侣蛋白,在激素信号转导、细胞分化、细胞增殖与凋亡、形态发生与进化、变态发育及应激防御等多重调节路径中发挥关键作用。采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了牙鲆两种HSP90基因在仔鱼发育和在成年组织中的表达变化。结果表明,HSP90α在成鱼骨骼肌、肠和胃中有较高的表达,而HSP90β在成鱼脑、脾脏和肾脏中有较高的表达。HSP90αmRNA水平在仔鱼变态期间迅速增加,至变态高峰G期达到最高水平;相反,HSP90β转录在仔鱼整个变态期间变化不是特别明显。鉴于甲状腺激素(thyroid hormone,TH)在牙鲆变态中的重要作用,还运用外源的TH及硫脲(thiourea,TU)处理牙鲆仔鱼来确定TH对HSP90基因转录的调节。与未处理组相比,HSP90α转录在TH处理8d和13d的仔鱼中显著增加,而在TU处理仔鱼中明显减少;但HSP90βmRNA水平不受药物处理影响。从上述结果分析,牙鲆中HSP90α的转录很可能被甲状腺激素上调,而且其在牙鲆的变态发育中发挥了重要作用。