番鸭呼肠孤病毒和H9亚型禽流感病毒共感染对番鸭法氏囊和抗体产生的影响

为探讨番鸭呼肠孤病毒(MDRV)和H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)共感染对番鸭法氏囊免疫应答能力的影响,本研究将MDRV或/和H9 AIV人工感染8日龄番鸭,观察法氏囊病理组织学变化,检测法氏囊B细胞增殖能力及RE-5 AIV疫苗免疫后抗体变化规律.结果显示:H9 AIV感染组番鸭发病率低(10％),无死亡,法氏囊无病理变化,显著抑制番鸭法氏囊细胞增殖反应;MDRV感染番鸭发病率70％,死亡率40％,生长迟缓,法氏囊病理变化为萎缩,淋巴细胞减少,局部出现范围较小的坏死灶,番鸭法氏囊细胞增殖反应下降;共感染组番鸭发病率100％,死亡率80％,番鸭生长迟缓,法氏囊萎缩和淋巴细胞增殖反应下降程度均比单一病毒感染组严重.病毒感染使番鸭对RE-5 AIV疫苗免疫应答能力明显下降,其共感染组抑制抗体应答程度最严重;共感染组的病毒检出时间早于并且检出率大于单一病毒感染组.表明MDRV与H9 AIV共感染在番鸭免疫应答抑制方面有协同作用.     

H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

从临床表现呼吸困难并伴有啰音、肺部和支气管黄色干酪样栓塞为特征的病鸡肝脾肺混合匀浆中分离到1株病毒（YD株）,该病毒能凝集鸡红细胞并能被AIVH9标准阳性血清抑制,对热不稳定且对热敏感;对鸡胚和番鸭胚的最小致死量分别为10^-7和10^-6,其MDT分别为78h和70h;鸡胚尿囊液毒的HA效价和EID50明显高于番鸭胚尿囊液毒;能扩增出大小约为1027bp的特异性目的片段。结果表明．该分离毒为H9亚型禽流感病毒。     

应用半套式RT-PCR技术诊断番鸭呼肠孤病毒病

参考GenBank中番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)S1基因序列设计并合成3条引物C1、HP11和HP12,组成半套式RT-PCR,扩增片段为300 bp.应用该半套式RT-PCR对MDRV、禽呼肠孤病毒(ARV)、番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸡胚成纤维细胞(CEF)和番鸭胚成纤维细胞(MDEF)培养物进行扩增.结果仅能从MDRV中扩增出300 bp特异片段,而不能从ARV、MPV、GPV、CEF和MDEF细胞培养物中扩增出特异片段;该方法检测灵敏度为1 fg核酸,重复性好.对人工感染和临床疑似病例用病毒分离和半套式RT-PCR进行检测,2种方法符合率为100%.因此,该半套式RT-PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒病的临床快速检测.     

番鸭小鹅瘟弱毒D株NS蛋白抗原位点特征分析

为获得番鸭小鹅瘟病毒弱毒株(MDGPV-D)非结构蛋白NS基因的相关信息,根据已发表的MDGPV-PT株全基因序列,应用DNAStar分子生物学软件设计1对引物,采用高保真PCR技术扩增MDGPV-D株NS全基因序列。对番鸭小鹅瘟病毒疫苗弱毒D株(MDGPV-D)NS基因进行克隆、测序,并利用生物信息学技术分析MDGPV-D株NS蛋白的同源性、遗传衍化、N-糖基化位点、磷酸化位点、B细胞抗原表位、T细胞抗原表位及其二级结构。结果表明,D株NS全基因大小为1 884bp,编码627个氨基酸(GenBank登录号:JF926696),与MDPV NS基因的亲缘性最近核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为97.9%～98.6%,97.6%～98.2%;MDGPV-D株NS蛋白具有3个潜在的N-糖基化位点和27个磷酸化位点,可能存在11个B细胞抗原表位,13个CD8+CTL表位,10个CD4+Th抗原表位;二级结构分析显示,α螺旋和无规则卷曲含量高,分别为40.67%、41.15%,而β转角仅占4.63%。与亲本强毒PT株相比,弱毒D株的NS蛋白存在2个定点突变,分别位于核苷三磷酸区域(第338位氨基酸)与CD4+Th抗原表位(第225位氨基酸)。     

番鸭呼肠孤病毒病雏番鸭实质器官的超微结构

对人工感染番鸭呼肠孤病毒发病雏番鸭的心、肝、肺、肾、脾脏、胸腺、法氏囊等7种实质器官的超微结构进行了观察。电镜下发现：心、肝、肺、肾等实质器官出现不同程度的细胞变性、水肿以及局灶性溶解坏死；各器官血管内皮细胞脂滴增多、水肿以至坏死脱落．通透性增加；浆细胞、淋巴细胞和吞噬细胞呈散在或灶性浸润于坏死区和实质细胞间。免疫器官脾脏、胸腺和法氏囊中的部分淋巴细胞、浆细胞坏死和不同程度凋亡，且细胞溶解坏死形成大小不一的坏死灶并被大量增生的吞噬细胞所吞噬，淋巴细胞数量明显减少。上述结果提示，番鸭呼肠孤病毒能导致番鸭免疫抑制。     

2012—2018年福建省部分地区番鸭临床病例细小病毒病病原检测

为初步了解福建省番鸭细小病毒病流行情况,提出相应的防控方法,2012—2018年,在福州、莆田、漳州和三明4个主要番鸭饲养区18个固定养殖场,收集435例临床病例样品,进行番鸭细小病毒病(番鸭三周病和番鸭小鹅瘟)病原检测,分析病原感染状况。结果显示:2012—2018年,在435例临床病例中,检出番鸭细小病毒病病原阳性病例155例,阳性检出率为35.6%(155/435),其中番鸭三周病阳性病例102例,番鸭小鹅瘟阳性病例125例,两种病混合感染病例72例。2012—2014年,番鸭三周病病原检出率约为40.0%,2015年降至27.4%,2016—2018年降至5.0%以下,病原检出率大幅下降(P<0.01);2012—2018年番鸭小鹅瘟病原检出率在23.4%~34.9%之间,检出率下降不明显(P>0.05)。分析认为,2014年番鸭三周病商品疫苗的推广应用大大降低了三周病的临床发病率,使该病已非导致番鸭临床发病的主要因素;而对于番鸭小鹅瘟,因缺乏针对性的有效疫苗,防控效果不明显。因此,该地应继续加强番鸭三周病活疫苗的免疫,最终净化该病;而对于番鸭小鹅瘟,需做好综合防控,可免疫鹅细小病毒弱毒疫苗,控制临床发病,减少疫病造成的损失。     

温和气单胞菌Z-1株培养特性、免疫原性和毒力的研究

报道了温和气单胞菌Aeromonas sobria Z-1菌株连续传代培养特性、免疫原性及毒力的稳定性.将Z-1菌株在营养琼脂培养基上连续传代至第35代[Z-1(35)],分别检测Z-1(1)、Z-1(5)、Z-1(15)、Z-1(25)和Z-1(35)的培养特性、菌体抗原性及毒力.结果表明:连续传代至35代,Z-1菌株的培养特性、免疫原性及毒力没有显著差异;Z-1株可作为理想的疫苗生产株.     

鹅细小病毒诱导番鸭胚成纤细胞自噬

细胞自噬在病毒生命周期中发挥着重要作用,目前国内仍然没有鹅细小病毒(GPV)与细胞自噬关系的系统研究。本研究旨在探讨番鸭小鹅瘟病毒(MDGPV)PT株与短喙矮小综合征鹅细小病毒(SBDS-GPV) M15株细胞适应毒感染番鸭胚成纤维细胞(MDEFs)后对细胞自噬的影响,以及细胞自噬对病毒增殖的作用。通过激光共聚焦方法观察自噬标记物LC3-Ⅱ特异绿色荧光聚集颗粒,借助蛋白免疫印迹检测LC3蛋白与p62蛋白的表达量,以及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白转化分析,确定GPV感染能够促进细胞自噬发生。利用膜通透性半胱氨酸蛋白酶抑制剂阿洛司他丁、自噬诱导剂雷帕霉素以及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤,调控自噬来研究细胞自噬对病毒增殖的影响,结果显示细胞自噬有利于GPV在MDEFs中的复制。结果表明GPV感染能够诱导细胞自噬,同时细胞自噬有利于病毒在宿主细胞中的复制。     

新型鸭呼肠孤病毒RT-PCR方法的建立与应用

研究建立检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的RT-PCR方法,并运用建立的检测方法对分离毒与人工感染样品进行应用检测.根据NDRV-NP03株S3基因全序列(NDRV-NP03,GenBank登录号:GQ888710),设计合成了一对引物,以NDRV分离株为模板,建立了检测NDRV的RT-PCR方法.结果显示:该方法仅能从NDRV分离毒中扩增到与预期大小相符长度为586 bp的特异性目的片段,检测灵敏度达到2 pg病毒RNA,而其它病毒,番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)、鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)、鸭副粘病毒(Duck paramyxovirus,DPMV)、鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)等样品的扩增结果均为阴性.应用该方法对8株NDRV分离毒和3份人工感染鸭肝脾组织进行检测均为阳性.表明建立的RT-PCR方法特异性强、敏感度高,可用于NDRV的临床诊断和流行病学调查.     

MTT法检测番鸭外周血淋巴细胞转化功能的研究

为了建立番鸭淋巴细胞转化检测的MTT法 ,筛选细胞浓度、刀豆蛋白ConA浓度和培养时间 3个参数对试验条件进行了研究。结果确定了MTT法检测番鸭淋巴细胞转化能力的最佳培养条件 ,细胞浓度 5× 1 0 6个 /mL在 2 0 μg/mLConA的RMPI 1 640完全培养基 40℃培养 60h。试验表明 ,该方法可用于番鸭体外细胞免疫功能的检测