肿瘤端粒酶靶向腺病毒载体的表达活性

目的　构建针对端粒酶阳性肿瘤的特异性腺病毒载体 ,研究其介导目的基因在肿瘤细胞内的定向表达能力。方法　将端粒酶逆转录酶 (hTERT )启动子克隆入质粒 pDC3 12的多克隆位点构成外源基因表达盒 ,在基因表达盒上下游分别插入 1个绝缘子序列 ,构建针对端粒酶阳性肿瘤的特异性腺病毒载体pSG TPE ;采用Luciferase报告基因进行hTERT启动子的活性分析 ;以pSG TPE携带绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因 ,重组腺病毒AdTPE EGFP ,观察其介导EGFP在肿瘤细胞内的定向表达能力 ,并与CMV启动子控制的腺病毒AdCMV EGFP作对照。结果　hTERT启动子在正常细胞内几乎没有活性 ,而在肿瘤细胞内的活性与SV 40启动子相近。腺病毒AdTPE EGFP能介导EGFP在肿瘤细胞内定向而稳定表达 ,在正常细胞内不表达 ,而对照腺病毒AdCMV EGFP在肿瘤和正常细胞内均表达EGFP。结论　靶向端粒酶阳性肿瘤的腺病毒载体 pSG TPE ,不但提高了对基因表达调控的特异性 ,而且降低了对正常细胞毒性作用。绝缘子的应用隔断了外源基因表达盒和病毒基因表达调控序列之间的互相干扰 ,进一步提高目的基因的表达效率。该载体对肿瘤的靶向基因治疗具有重要的应用价值。     

DETECTION OF HUMAN TELOMERASE ACTIVITY BY TELOMERASE TRAP-ELISA ASSAY

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MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白的制备及其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

目的：构建MDA-7/IL-24-HT7原核及真核表达质粒,制备MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白,研究该融合蛋白在肿瘤细胞内的定位及其对肿瘤细胞致凋亡作用。方法：PCR扩增MDA-7/IL-24基因,插入含有HaloTag (HT7)标签的载体中,构建MDA-7/IL-24-HT7原核及真核表达质粒;MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白经IPTG诱导表达后纯化。利用带有荧光标记的HT7配基观察MDA-7/IL-24-HT7在肿瘤细胞内的定位。MTT法及AnnexinV-PI染色法检测MDA-7/IL-24-HT7对肿瘤细胞生长和凋亡的影响。结果：成功构建了表达MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白的原核及真核表达质粒,MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白主要存在于E.coli BL21的包涵体内。MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白定位于肿瘤细胞的内质网上。MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白可抑制肿瘤细胞的生长,1 mg/ml MDA-7/IL-24-HT7 融合蛋白作用大肠癌HCT116细胞、肝癌SMMC7721细胞96 h后,细胞凋亡率分别为（34.7±1.3）% 和（22.1±0.9）%,显著高于未处理的肿瘤细胞（P<0.01）。结论：带有HaloTag标签的MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白可抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡。     

腺病毒载体携带人TRAIL基因治疗H446小细胞肺癌的体外实验研究

目的评价携带人TRAIL基因的腺病毒载体对人小细胞肺癌细胞株H446的基因治疗功效。方法构建的携带人TRAIL基因的腺病毒Ad-hTRAIL,感染人小细胞肺癌细胞株H446以及人正常肝细胞株WRL-68,人正常成纤维细胞株MRC-5,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测其杀伤肿瘤细胞的效能,流式细胞术(FCM)检测Ad-hTRAIL对细胞早期凋亡的影响,并进行RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TRAIL mRNA和TRAIL蛋白的表达量。结果携带人TRAIL基因的增殖缺陷型腺病毒Ad-hTRAIL对H446细胞的感染效率较高;感染72h后H446、WRL-68、MRC-5细胞培养上清中TRAIL的表达量分别为32.02、17.08、16.89μg.L-1,在MOI=1.0时,Ad-hTRAIL即可引起H446细胞明显凋亡;而在MOI=100时对正常细胞WRL-68、MRC-5也没有明显杀伤作用。结论Ad-hTRAIL能够强烈诱导小细胞肺癌细胞H446凋亡而对正常肝细胞及成纤维细胞无明显抑制作用,Ad-hTRAIL在小细胞肺癌的基因治疗方面有潜在的应用前景。     

RU486调控的红色荧光蛋白真核载体的构建及表达

目的 构建一种带有DsRed红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,并在体外验证其调控表达作用.方法 利用分子生物学技术,将DsRed基因和启动子,以及RU486系统构建成真核可凋控载体pRSl7.RUDsRed.在转染MFC细胞后,运用荧光显微镜和流式细胞技术检测该载体的调控表达.结果 PCR和限制性酶切及测序均证实了载体的正确性.没有RU486时,几乎没有红色荧光蛋白的表达,加入诱导剂RU486后,可以实现红色荧光蛋白的高效表达.结论 成功构建了带有红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,实现了对目的 基凶表达的有效调控,为进一步的基因调控研究和和基因治疗奠定了基础.     

K562／H20和K562／Mel细胞株对高三尖杉酯碱与马法兰耐药机制的比较研究

为比较高三尖杉酯碱和马法兰的耐药机制，对天然来源抗肿瘤药物高三尖杉酯碱耐药株Ｋ５６２／Ｈ２０与烷化剂马法兰耐药株Ｋ５６２／Ｍｅｌ耐药机制进行研究，发现前者对长春新碱、柔红霉素、阿霉素具有广泛交叉耐药，对马法兰耐药水平较低；后者对氮芥、噻替派有明显交叉耐药。在耐药机制上，前者主要由于多药耐药基因过度表达所致，谷胱甘肽－Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）π、α基因也参与部分耐药机制；后者主要由于ＧＳＴα基因及ＧＳＴ总活性所致。两者似乎均通过ＧＳＴα基因表达升高起作用。     

慢性乙型肝炎的抗病毒研究进展

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的全球性传染病,HBV感染是我国肝硬化、原发性肝癌的重要原因。目前,干扰素类与核苷(酸)类似物抗病毒药物已广泛应用于临床,在一定程度上抑制了病毒的复制并控制了疾病的发展,但仍未从根本上清除病毒;各种治疗性疫苗在抗HBV方面也取得了一定疗效,但临床效果不佳。目前不少研究结果表明,生物免疫治疗可以成功清除体内的HBV,从而为乙肝的治疗带来新的希望。     

复制缺陷的重组腺病毒经心包腔转染急性心肌梗死猪观察

目的:评价重组腺病毒经心包腔转染的效率及持续时间.方法:应用磷酸钙沉淀方法制备携带大肠杆菌LacZ基因复制缺陷的重组腺病毒(Ad-LacZ).12头中国小型猪随机等分为实验组和对照组,采用球囊堵塞前降支第一对角支远端,心肌梗死模型建立后即刻采用经皮剑突下穿刺中心静脉导管心包腔内注射转染,28 d后处死.实验组胶原酶1 200 u及透明质酸酶3 000 u预处理心包后,在心包腔内注射Ad-LacZ基因2.0×109噬斑集落形成单位;对照组:同样方法预处理心包后,在心包腔内注射生理盐水1 ml.于注射后3 d、7 d及28 d分别对缺血心肌进行HE、HBFP及X-gal染色.结果:冠状动脉造影证实前降支远端完全闭塞,病理学检查显示心肌有缺血和梗死.实验组注射Ad-LacZ基因后第3 d、7 d及28 d后X-gal染色有阳性细胞,以7 d最明显,对照组28 d内均未发现阳性细胞.结论:应用球囊堵塞法可成功建立猪急性心肌梗死模型,胶原酶及透明质酸酶预处理心包后,腺病毒载体可转染缺血心肌,并持续表达4周.     

增殖性腺病毒CNHK600-p53的构建及对胰腺癌细胞抑制的体外实验研究

目的 探讨携带p53基因的新型增殖性腺病毒CNHK600-p53的导入能否增加胰腺癌细胞株PANC1对化疗药物的敏感性.方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,观察化疗药物5-FU、丝裂霉素(MMC) 和表阿霉素(epirubicin, EPI)单独应用及与CNHK600-p53联合应用对胰腺癌细胞株PANC1的杀伤效应.结果 PANC1在5-FU浓度为400 μg/ml时细胞抑制率为(65±4.2)%,MMC浓度为1 μg/ml时细胞抑制率为(41±1.9)%,EPI浓度为10 μg/ml时细胞抑制率为(65±1.8)%.转入CNHK600-p53(MOI = 0.625)后再使用上述浓度的化疗药物,PANC1的细胞抑制率分别为(89±5.3)%、(60±2.3)%和(75±1.5)%.当MOI值为0.3125、0.625、1.25时,CNHK600-p53组和Ad-p53组的细胞抑制率分别为(27±2.5)%、(30±3.7)%、(61±4.3)%和(4±2.7)%、(5±3.5)%、(16±4.5)%.结论 单用CNHK600-p53效果优于Ad-p53,携带p53基因的CNHK600-p53能提高胰腺癌细胞株PANC1对化疗药物的敏感性.     

延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因敲除大鼠胚胎干细胞株的建立

背景:小鼠肝损伤模型已被广泛应用,大鼠肝损伤模型能在发病机制,肝移植环境等方面更好地模拟人,建立大鼠延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fuarylacetoacetat hydrolase,Fah)基因敲除的胚胎干细胞株是大鼠肝损伤模型建立的重点和难点。目的:建立Fah基因缺失的大鼠胚胎干细胞株。方法:根据Genbank检索出的大鼠Fah基因序列构建带有正负双向筛选系统的Fah基因敲除载体pKO-Fah,并进行大鼠胚胎干细胞制备与培养,通过电穿孔转染将线性化质粒转入大鼠胚胎干细胞中,用嘌呤霉素和增强型绿色荧光进行克隆的筛选,再对筛选出来的阳性克隆进行PCR验证。结果与结论:电穿孔转染后观察到绿荧光胚胎干细胞克隆,经过3轮嘌呤霉素药物筛选后约有90%的胚胎干细胞克隆表达绿荧光,成功挑取到2个稳定表达绿荧光的胚胎干细胞克隆,重组胚胎干细胞-Fah,通过PCR鉴定为正确同源重组的阳性克隆。提示大鼠胚胎干细胞稳定建系后,能通过传统的同源重组方法来建立基因敲除胚胎干细胞,并为后期基因敲除动物的建立奠定基础。