东方田鼠和小鼠感染日本血吸虫后血清NO的变化以及肝、肺病变的比较

目的了解日本血吸虫适宜宿主和非适宜宿主在感染后血清NO含量的变化规律以及肝、肺组织感染后的病变情况，以比较不同宿主对日本血吸虫感染的反应。方法东方田鼠和小鼠分别感染尾蚴1000条和40条，每2d分别剖杀2只，观察两宿主肝、肺变化，同时分别检测各宿主血清中NO的含量。结果小鼠和东方田鼠感染日本血吸虫后，肺部出现程度不同的出血现象。感染10d后出血现象均自行消失。其中，小鼠肝表观正常，但30d后肝中出现卵引起的内芽肿。东方田鼠在感染后6d肝中开始出现童虫所致病变，感染后第12～14d时逐渐减少，20d后病变消失。其间，小鼠和东方田鼠血清NO水平表现出不同的变化规律。东方田鼠感染后血清NO水平由正常的100μmol／L降到16μmol／L，18～20d恢复到原来的水平，完成一个完整和规律的循环。小鼠感染日本血吸虫后NO水平变化较大，第36d后，血清NO水平基本上维持在0～10μmol／L之间较低的、非正常水平。结论日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠感染日本血吸虫后肝、肺病变特征以及NO水平变化与日本血吸虫适宜宿主小鼠不同，提示东方田鼠感染后体内存在一个敏感和系统的抗感染过程。     

两个山丘型疫区牛血吸虫病疫情动态纵向观察

目的了解山丘型血吸虫病疫区牛血吸虫病流行动态,为正确评估防治效果、制订防控对策提供参考依据。方法选择两个有代表性的山丘型疫区仁美和大仓作为观察点,采用毛蚴孵化法检查牛血吸虫感染情况,比较不同年龄牛感染率;入户调查家畜放牧行为,每年4、9月调查野粪和钉螺分布及感染率。结果与1993年比较,2007年仁美和大仓观察点牛血吸虫感染率分别下降98.4%和93.8%;感染度亦呈下降态势,至2007年基本以低感染度为主。1995年以后仁美观察点野粪阳性率为0,大仓点至2007年处于较低徘徊状态;活螺密度和阳性螺密度呈下降趋势。结论山丘型血吸虫病流行区由于自然环境特殊,疫区往往呈点状或带状分布,加大查治病和扩大化疗力度可迅速降低血吸虫病疫情。要彻底阻断血吸虫病传播还必须加强钉螺孳生环境改造和家畜血吸虫病传染源管理。     

18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库的构建

为揭示血吸虫生长发育机理,深入研究血吸虫与宿主、血吸虫雌雄虫之间蛋白质的相互关系,本研究选取血吸虫进入终末宿主体内18天时的虫体(发育成熟初期),采用Clontech Matchmaker技术成功构建日本血吸虫的酵母双杂交cDNA文库.该文库具有基因多样性和足够大的库容量,库容量为2.5×106 pfu/mL,插入的双链cDNA片段的长度在0.25～2.0 kb之间,文库重组比率为97.9%,具有良好的代表性.该文库的构建为筛选相互作用蛋白并进一步阐明其生理意义提供了基础.     

日本血吸虫m6A修饰的性别相关circRNA鉴定

目的 研究日本血吸虫雌雄成虫环状RNA (circRNA)的N6-腺苷酸甲基化(m6A)修饰,并对circRNA可能调控的miRNA进行预测。方法 取(100±2)条日本血吸虫尾蚴,经腹部皮肤感染小鼠20 min,28 d后麻醉小鼠,用肝门静脉灌洗法收集虫体,分离雌雄虫,提取雌雄虫总RNA,分别取0.5μg和1.0μg点样在尼龙膜上,转移至紫外交联仪中,依次与m6A抗体(1∶1 000)和HRP标记的二抗(1∶5 000)孵育,进行斑点杂交。取雌雄虫总RNA各1μg,应用RNA甲基化共沉淀试剂盒进行免疫沉淀分离,RNA建库试剂盒进行建库,生物分析仪质量检测后在高通量测序仪上采用150 bp双端模式进行测序。应用Cutadapt软件(v1.9.3)除去序列中的接头与低质量序列,获得高质量序列。使用Bowtie2软件将序列与血吸虫基因组(Sja＿WBPS14)匹配,以Find＿circ软件识别序列中的circRNA,MACS软件识别序列中的甲基化位点。利用Heatmap2软件对差异表达的circRNA进行聚类分析,对差异有统计学意义的m6A修饰的circRNA进行来源基因的基因本体论(GO...     

编码日本血吸虫Argonaute 3蛋白全长cDNA的获得及初步研究

目的获得日本血吸虫Argonaute3(Ago3)蛋白的全长编码cDNA并对其初步分析。方法利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得日本血吸虫Ago3蛋白全长编码cDNA,利用原核表达系统对此蛋白片段进行重组表达,采用亲和层析法纯化重组蛋白,并免疫动物制备多克隆抗体。利用Western blot技术分析该蛋白在日本血吸虫中的表达。结果采用RACE获得了日本血吸虫Ago3蛋白编码全长cDNA,长度为2772bp;利用原核表达系统获得了该蛋白片段的重组融合蛋白,并制备了多克隆抗体;Western blot分析表明,该抗体与日本血吸虫全虫蛋白在分子量约为100kDa处具有特异性反应。结论获得了编码日本血吸虫Ago3蛋白的全长编码cDNA,并制备了多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

日本血吸虫抱雌沟蛋白基因表达的性别与时相差异性研究

用Southernblotting ,Northernblotting技术对所克隆的日本血吸虫抱雌沟蛋白编码基因SjGcp进行了性别和时期差异表达研究。结果显示日本血吸虫抱雌沟蛋白基因为雄虫特异性表达基因 ,在感染后第 14天即雌雄虫将合抱前可见转录表达     

日本血吸虫卵壳蛋白前体基因Sj423的克隆表达及分析

据日本血吸虫菲律宾株编码卵壳前体蛋白的一段230bp的序列设计PCR引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增出日本血吸虫中国大陆株相应的基因片段、然后根据测序结果设计一系列引物,用5’RACE和3’RACE法扩增出该基因cDNA的5’和3’端,再根据测序结果设计全长引物,用RT-PCR方法扩增出大小为423bp的片段。经序列分析推断该基因片段为编码日本血吸虫中国大陆株卵壳前体蛋白基因的完整阅读框,对相应基因组区段测序证实该基因没有内含子(GenBank登录号:AF519182)。将其克隆到表达载体pET28c(+)中,在大肠杆菌中获得表达,融合表达产物分子量约为20.9 kD。Real-ti me PCR结果显示该蛋白在尾蚴感染宿主后第23d即卵壳形成时高表达。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性。     

编码日本血吸虫Argonaute蛋白全长cDNA克隆、表达及初步鉴定

目的获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA,并进行克隆和重组融合蛋白表达。方法利用RACE技术获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA并对其进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(Realtime PCR)分析该基因在日本血吸虫中的转录情况。原核表达保守功能域蛋白和全长蛋白,利用保守功能域重组融合蛋白免疫昆明系小鼠制备多克隆抗体。免疫印迹(Western blot)进行免疫学分析。结果本研究获得了一个编码日本血吸虫Argo-naute基因的全长cDNA,其完整开放阅读框为3 030 bp,编码1 009个氨基酸,预测分子量为111.7 kDa。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白序列具有Argonaute家族蛋白的典型结构域特征,且与人、鼠Argonaute蛋白具有较高的同源性。Real-time PCR分析表明该基因在7,14日龄的日本血吸虫童虫中转录较高。Western blot分析制备的多抗具有较高的特异性并能识别全长融合蛋白。结论获得了编码日本血吸虫Argonaute基因的cDNA及重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

日本血吸虫4个基因启动子相关序列的克隆和初步研究

目的 比较4个日本血吸虫基因启动子相关序列对荧光素报告基因的表达情况。方法 利用PCR技术扩增4个日本血吸虫基因启动子的相关序列, 并利用常规分子生物学技术将PCR产物克隆到荧光素酶报告基因的上游。利用脂质体转染和电穿孔技术将纯化的重组质粒分别转染到HEK293细胞和日本血吸虫体内, 并以荧光素酶检测系统测定了报告基因表达情况。结果 PCR扩增获得了日本血吸虫卵壳蛋白 （Eggshell protein, ESG?2A）、 延伸因子1 （Elongation factor 1 al? pha 1, EF）、 烯醇酶 （Enolase, EN） 和抱雌沟蛋白 （Gynecophornal canal protein, GCP） 基因的启动子相关序列, 并将它们成功地克隆到pGlu?Basic载体。重组质粒转染表明4个日本血吸虫启动子相关序列均可驱动荧光素酶报告基因在HEK293细胞和日本血吸虫虫体表达。其中含有GCP和EN启动子相关序列的重组质粒可在HEK293细胞及其培养基中检测到较高的荧光素酶活性, 含有GCP和ESG的重组质粒可在日本血吸虫虫体培养基中检测到较高的荧光素酶活性。结论 获得的4 个日本血吸虫启动子相关序列均可驱动荧光素酶报告基因在HEK293细胞和日本血吸虫虫体表达, 为进一步利用这些启动子相关序列开展血吸虫基因操作研究奠定了初步基础。     

血吸虫发育调控的信号转导研究进展

血吸虫为扁形动物门、裂体科的雌雄异体寄生虫。由血吸虫感染引起的血吸虫病是一种严重危害人畜健康的寄生虫病 ,为仅次于疟疾的第二重要热带病。该病在全球 76个国家和地区流行 ,共约 2亿患者 ,6亿人群受威胁。目前 ,在我国尚在 10 8个县和 5 7个县级农场流行 ,共有患者 82万〔1〕。每年为防治此病支出巨大 ,药物治疗不能控制再感染。种种因素表明迫切需要利用现代分子生物学技术开发高效的血吸虫病免疫预防苗。血吸虫成虫主要寄生于宿主的肝门和肠系膜静脉。在脊椎动物体内不繁殖 ,危害不大 ,而性成熟的雌虫产生的大量虫卵及其在宿主肝脏…