结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧基酶诱导小鼠细胞和体液免疫应答

目的检测结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法选清洁级BALB/c小鼠60只,随机分为两组,实验组和对照组。实验组每只小鼠用表达的PEPCK融合蛋白10μg加弗氏不完全佐剂进行腹腔免疫注射,对照组小鼠仅用弗氏不完全佐剂注射。每隔2w免疫1次,共免疫3次。末次免疫2w后,分别取小鼠脾脏、血清,流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞,MTT法检测淋巴细胞对刺激的应答水平,ELISA检测血清各种细胞因子及抗PEPCK抗体。结果实验组小鼠的脾脏明显大于对照组小鼠的脾脏,且粘连严重,CD4+T细胞增殖明显(73.5±3.69),CD4+/CD8+比值显著升高(5.1±0.98)(P<0.01);且淋巴细胞的应答能力明显强于对照组小鼠;实验组小鼠血清中IFN-γ、IL-12和TNF-α明显高于对照组,血清抗体滴度随免疫次数逐步增高。结论结核杆菌PEPCK能够有效的刺激机体产生细胞免疫反应和体液免疫反应,尤以细胞免疫反应为主,是很好的抗结核候选疫苗分子之一。     

人类免疫缺陷病毒感染的免疫学

全世界已经有超过二千万人死于获得性免疫缺陷综合征（又称艾滋病）。人类免疫缺陷病毒（HIV）是引起艾滋病的病原体，是由Montagnier在1983年发现的。HIV是一种逆转录病毒，有两条单链RNA组成，在逆转录酶的作用下，转录成前病毒双链DNA。HIV主要通过使CD4T细胞衰竭来破坏免疫系统。当CD4 T细胞降至全血200个／mm^-3时，免疫系统功能就会发生紊乱，并且会伴随机会性感染如结核杆菌、隐孢子虫等。本文概述了由于HIV感染引起的复杂、多面性的免疫反应，并重点介绍了CD4 T细胞衰竭的机制。Th1和Th2辅助细胞的平衡改变也与疾病的进展有关。为了控制此疾病，研究者设计了多种疫苗，并且有些疫苗已经进入了临床试验阶段。     

刚地弓形虫ROP2-P30复合基因在E.coliBL21中的表达和鉴定(英文)

目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连接等反应,亚克隆入pET30a(+)原核表达载体构建pET ROP2载体,然后再将pMD P30中的P30基因片段与经BglⅡandEcoRⅠ酶切的pET ROP2载体连接,构建pET ROP2P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET ROP2和pET ROP2P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性。结论ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌感染中一些重要免疫细胞和细胞因子作用的研究进展

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuber-culosis M.TB）感染引起的,目前世界上死亡率最高的慢性传染病。每年约有800万人发病,200万人死亡^[1]。结核分枝杆菌寄生在巨噬细胞内,主要引起细胞介导的免疫反应。有效的疫苗和快速的诊断是控制此病的关键。本文综述了人体对抗结核分枝杆菌感染自然免疫中一些重要成分如巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞等的作用,也讨论了CD4和CD8 T细胞的重要作用。除此以外一些重要细胞因子如IFN-γ,TNF-α和IL-12等作用的研究进展也在此阐述。     

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH的构建及鉴定

目的构建尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛的fimH基因真核表达载体,为尿路致病性大肠埃希菌的核酸疫苗研制奠定基础。方法通过PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌临床分离株的fimH全基因序列,克隆至pMD19-T载体,PCR、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒,并进行PCR和酶切鉴定。结果 PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌fimH基因片段为910 bp;构建的pcDNA3.0-fimH重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,产生1个与fimH基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-fimH重组质粒的大片段,表明fimH基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建尿路致病性大肠埃希菌fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH。     

抗弓形虫P30单克隆抗体的制备及其抗虫作用观察

制备抗弓形虫天然P30、重组P30的单克隆抗体(mAb),并研究它们对虫体的影响,为弓形虫病诊断及保护性抗原鉴定奠定基础。采用弓形虫天然P30、重组P30及全虫抗原(对照)分别免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选稳定分泌高滴度mAb的杂交瘤细胞株。用ELISA法测定mAb亚类和效价;通过SDS-PAGE和West-ern blot进行特异性鉴定;Giemsa染色观察杂交瘤细胞的染色体数目;利用扫描电镜及间接荧光抗体试验(IFAT)观察mAb对弓形虫的杀伤作用及其靶抗原定位。结果表明,筛选出2株(2B3、1H6)特异性较好、能稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。Western blot结果显示,2B3、1H6产生的mAb与弓形虫全抗原的阳性反应带均在30 000 Mr处;mAb亚类均属IgM,其效价(ELISA)分别为:2B3 1∶102 400、1H6 1∶51 200;2株细胞的染色体数均在100条以上。电镜观察与mAb作用后的弓形虫虫体聚集、肿胀,膜变厚,表面出现缺口和空洞,甚至虫体变形、破碎。抗弓形虫天然P30的mAb能识别重组体pET-30a-P30的表达蛋白。成功制备了抗弓形虫天然P30、重组P30的mAb,可进一步用于弓形虫病诊断及保护性抗原鉴定研究。     

结核分枝杆菌感染中一些重要免疫细胞和细胞因子作用的研究进展

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis M．TB）感染引起的，目前世界上死亡率最高的慢性传染病。每年约有800万人发病，200万人死亡。结核分枝杆菌寄生在巨噬细胞内，主要引起细胞介导的免疫反应。有效的疫苗和快速的诊断是控制此病的关键。本文综述了人体对抗结核分枝杆菌感染自然免疫中一些重要成分如巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞等的作用，也讨论了CD4和CD8T细胞的重要作用。除此以外一些重要细胞因子如IFN-γ，TNF—α和IL-12等作用的研究进展也在此阐述。     

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因核酸疫苗免疫效果评价

目的研究尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因核酸疫苗产生的免疫反应及其对小鼠的免疫保护作用,并比较不同免疫途径产生的免疫效果。方法选取BALB/c小鼠40只,随机分为4组(PBS组、空质粒组、pcD-NA3.0-fimH肌肉注射组、pcDNA3.0-fimH滴鼻组),用构建的fimH基因真核表达载体pcDNA3.0重组质粒分别通过肌肉注射和滴鼻(粘膜)免疫BALB/c小鼠,同时分别以载体质粒(pcDNA3.0)和PBS液为空质粒对照和空白对照,经股四头肌注射免疫小鼠,于第3周和第5周加强免疫。每次免疫前及末次免疫后2周采血检测特异IgG抗体。末次免疫后第10 d,以UPEC分离株菌液进行尿道上行攻击,攻击后第5 d进行尿液细菌培养和计数。结果免疫后,肌注组与滴鼻组小鼠血清特异性IgG抗体水平与对照组及空质粒组比较显著升高(P<0.05);UPEC分离株菌液攻击小鼠后,pcDNA3.0-fimH肌注组与滴鼻组小鼠尿液菌落数较对照组及空质粒组显著减少(P<0.05)。结论 pcDNA3.0-fimH基因疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫,对小鼠尿道上行感染具有一定的免疫保护作用,且不同的免疫途径免疫...     

弓形虫ROP2基因的克隆与鉴定

目的 体外扩增弓形虫棒状体分泌抗原2（ROP2）靶基因，构建真核表达载体pc-DNA3-ROP2。 方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子，提取基因组DNA；根据基因库ROP2基因序列设计合成1对引物，应用PCR扩增ROP2基因片段，回收纯化后克隆入TA载体质粒pUCm-T；用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切该重组子，将切下的ROP2基因在T4DNA连接酶作用下插入真核细胞表达载体质粒pc-DNA3，并进一步作双酶切、PCR及测序鉴定。 结果 以弓形虫基因组DNA为模板，PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段，克隆于pUCm-T载体中，再将ROP2基因亚克隆于真核表达载体质粒pc-DNA3，经筛选鉴定，构建pc-DNA3-ROP2重组质粒；测序结果显示，重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列，能完整表达ROP2的抗原蛋白。 结论 弓形虫ROP2基因片段，经TA克隆及亚克隆，构建弓形虫pc-DNA3-ROP2重组质粒。     

弓形虫ROP2核酸疫苗免疫保护作用的研究

目的 研究ROP2核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用。 方法 42只BALB/c小鼠随机分为3组：实验组、空质粒组和PBS对照组，各组小鼠分别肌注pc-DNA3-ROP2重组质粒50 μg、pc-DNA3空质粒50 μg和PBS 50 μl，共免疫3次，每次间隔3周，末次接种量均加倍。末次免疫后2周，各组分别取4只小鼠的血清、脾和淋巴组织，检测CD4⁺、CD8⁺ 及各细胞因子。其余各组每鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子500个，观察其存活时间等。 结果 ROP2核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应，小鼠血清抗体滴度高并能识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原；实验组小鼠的CD4⁺T细胞增殖明显(69.5±3.4)%、CD4+/CD8+ 比值显著升高(4.69±1.32)%（P<0.01）；其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-6、IL-12、γ干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF）均有不同程度的升高，尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染180 h后，实验组小鼠免疫保护率为88.9%，与对照组相比，小鼠存活时间明显延长、初始死亡时间明显推迟（P<0.01）。 结论 ROP2核酸疫苗具有较强的免疫原性，能产生良好的免疫保护作用。