猴痘F3L蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的 猴痘病毒(MPXV)是一种能引起人畜共患病的正痘病毒属病毒,在人群和野生动物中具有较高的感染率,对人类公共卫生安全造成重大威胁。当前猴痘病毒的相关研究基础较弱,猴痘诊断试剂匮乏。本研究旨在以猴痘病毒基因F3L为对象表达F3L重组蛋白并免疫小鼠,制备F3L多克隆抗体,为猴痘诊断试剂的研发奠定基础。方法 克隆猴痘病毒基因F3L,构建至原核表达载体pET-28a上,测序无误后将重组质粒pET-28a-MPXV-F3L转化E.coli BL21感受态细胞,用优化的IPTG诱导表达条件表达MPXV-F3L重组蛋白,表达蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后采用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备F3L多克隆抗体血清,采用ELISA检测血清抗体滴度。结果 克隆得到的猴痘病毒F3L基因片段长度为471 bp,表达的pET-28a-MPXV-F3L重组蛋白分子质量约为24.6 ku,其最佳表达条件为IPTG浓度0.2 mmol/L、温度42℃、时间12 h。表达蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后纯度达95.29%,经Western blot鉴定表达蛋白能...     

丙型肝炎病毒RNA聚合酶在HepG-2细胞的稳定表达及活性分析

目的:探讨丙型肝炎病毒RNA聚合酶(NS5B)在肝癌细胞株HepG-2的稳定表达与活性.方法:Sca I酶切合有丙型肝炎病毒NS5B基因的重组表达载体pcDNA-5B,线性化的pcDNA-5B通过脂质体介导转染HepG-2细胞,G418筛选转染细胞.阳性细胞经基因组PCR、RT-PCR和Western Blot鉴定.体外RNA聚合酶试验和荧光素酶试验鉴定稳定表达NS5B蛋白的RNA聚合酶活性.结果:NS5B基因可整合到转染的HepG-2细胞的染色体上,并能有效转录和表达.体外RNA聚合酶试验和荧光素酶试验表明稳定表达的NS5B在体外和细胞内均具备RNA依赖的RNA聚合酶活性.结论:肝细胞HepG-2可以稳定表达丙型肝炎病毒NS5B,且具备RNA依赖的RNA聚合酶活性.     

持续表达的丙型肝炎病毒NS4B激活HepG2细胞内质网应激反应的研究

目的研究持续表达的丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)对HepG2细胞内质网应激反应的影响。方法 NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染HepG2细胞,G418筛选、基因组PCR和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内人X盒结合蛋白1(XBP1)mRNA剪接,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78启动子、XBP1启动子和核因子κB(NF-κB)活性。结果基因组PCR和Western blot鉴定证实NS4B基因整合到转染HepG2细胞的染色体上,并有效表达;在NS4B稳定转染的HepG2细胞中,检测到XBP1mRNA剪接、XBP1和Grp78启动子激活、Ca2+稳态变化及NF-κB激活。结论 NS4B在HepG2的稳定表达诱导了内质网应激反应,揭示NS4B可能通过诱导肝细胞内质网应激反应在HCV感染及其致病性中发挥作用。     

HCV NS5B在人肝癌细胞系Huh7细胞内的表达及活性分析

目的为靶向抗HCV药物筛选奠定基础。方法使用脂质体将包含HCV非结构蛋白5B（NS5B）基因的重组载体pcDNA-5B转染至人肝癌细胞系Huh7细胞,分别采用RT-PCR和Western Blot鉴定NS5B mRNA和蛋白表达,采用荧光素酶试验检测NS5B细胞内RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）活性。结果转染的Huh7细胞出现1．8kb的特异性NSSB mRNA目的带及一条相对分子质量约66kD的蛋白目的带,且后者具有细胞内RdRp活性。结论人肝癌细胞系Huh7细胞可成功表达具有细胞内RdRp活性的NS5B,以其为靶标的抗HCV药物可为临床治疗提供新思路。     

丙型肝炎病毒NS5B在Hep3B细胞的表达及活性分析

目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检测NS5B的细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结果RT-PCR和Westernblot发现转染NS5B基因的Hep3B细胞产生NS5B mRNA和NS5B蛋白,荧光素酶分析表明Hep3B细胞表达的NS5B蛋白具有细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结论人肝癌细胞系Hep3B细胞可以成功表达NS5B基因,且表达的NS5B蛋白具备细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。     

论食品卫生法律体系

一、食品卫生法律体系的含义与形成回顾体系是指若干有关事物或某些意识互相联系、互相制约而构成的一个整体;而法律体系是指由各法律部门组成的一国现行法律有机联系的统一整体。因此,我们试将食品卫生法律体系理解为:由国家制定,反映国家食品卫生意志的若干法律法规及其与之配套的一系列规范性文件、卫生标准、技术规范等组成的有机统一整体。1995年10月30日《中华人民共和国食品卫生法》的实行和《试行法》的自行终止,标志着我国食品卫生法律体系正日臻完善,回顾该体系形成与完善的历程,也就是食品卫生监督长期实践、总结与发展的过程。…     

食品卫生监督体制转轨中若干问题及其对策的探讨

食品卫生监督体制转轨中若干问题及其对策的探讨常德市武陵区卫生防疫站（４１５０００）孔令保一、问题的提出及转轨的法律依据１９９５年１０月３０日，《中华人民共和国食品卫生法》（下称新法），经第八届全国人民代表大会常务委员会第十六次会议通过，并自公布之日施...