美洲水貂TYR基因编码蛋白结构及功能的生物信息学分析

为进一步探明美洲水貂酪氨酸酶(TYR)基因的结构和功能信息,对美洲水貂TYR基因编码蛋白进行生物信息学分析,同时构建TYR基因的系统发育树。结果表明:美洲水貂TYR基因共编码531个氨基酸,其编码产物为不稳定的亲水蛋白;二级结构主要以α-螺旋和无规卷曲为主,含有1个酪氨酸酶超家族结构域,存在信号肽、跨膜结构域和二硫键;该蛋白主要在内质网中发挥细胞被膜、运输和结合的作用,同时还通过信号转导在细胞内发挥其生物学作用;系统进化情况和动物分类学基本一致,美洲水貂TYR基因与雪貂、家犬的亲缘关系最近。美洲水貂TYR基因编码蛋白在生物进化中具有较强保守性,该基因结构和功能的分析为水貂TYR基因遗传特性的进一步研究奠定了基础。     

蓝狐MITF-M基因序列扩增及生物信息学分析

试验旨在研究蓝狐MITF-M基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、基因编码蛋白结构及功能,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据。从成年蓝狐背部皮肤组织中采集1 cm×1 cm样品,采用RT-PCR扩增及测序技术首次获得MITF-M基因序列3 880 bp（包括5'侧翼区2 262 bp、CDS区1 260 bp、3'侧翼区358 bp）,编码419个氨基酸残基。生物信息学分析结果显示,蓝狐MITF-M基因5'侧翼区存在潜在的启动子区域（-86~-336 bp）,且发现TATA框、CAAT框、GC框和CRE等调控元件及CREB、LSF和Sp1等多种转录因子。MITF-M基因编码的蛋白是定位于细胞核和细胞质的不稳定、可溶性亲水蛋白质。亚细胞定位结果提示该蛋白在细胞核、细胞质和线粒体的概率较高,分别为65.2%、17.4%和8.7%。DNAMAN软件对MITF-M基因编码蛋白的二级结构预测发现,该蛋白由α螺旋（33.66%）、β折叠（16.66%）和无规卷曲（49.68%）组成,且不存在跨膜区域和信号肽。蓝狐与其他物种MITF-M基因编码的氨基酸序列同源性对比和系统进化树分析均提示蓝狐与犬的遗传亲缘关系最近,与哺乳动物和禽类均具有较高的同源性（>89.1%）,说明MITF-M基因编码区在物种进化过程中较为保守。本研究为深入研究MITF-M基因调控狐狸被毛颜色的分子遗传机制奠定了理论基础。     

坝上长尾鸡与海兰褐鸡肌肉营养成分对比研究

坝上长尾鸡是河北省唯一被列入《中国畜禽遗传资源志》的地方家禽品种。为了更好地保护和开发利用坝上长尾鸡资源,本试验选取相同饲养管理条件下200日龄的该鸡种和海兰褐鸡各180只,每组随机分为5个重复,每个重复36只。在同一条件下常规饲养,于230日龄每组挑选10只鸡屠宰,对肌肉中主要营养成分进行了比较分析。结果显示:1)坝上长尾鸡肌肉中的粗蛋白质和粗脂肪含量与海兰褐鸡相比差异不显著(P0.05)。2)2个鸡种间胸肌、腿肌中的必需氨基酸含量差异不显著(P0.05);坝上长尾鸡肌肉中的呈味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸)含量显著高于海兰褐鸡(P0.05),腿肌中的苦味氨基酸——苯丙氨酸含量显著低于海兰褐鸡(P0.05)。3)坝上长尾鸡腿肌中的不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸和总脂肪酸含量显著低于海兰褐鸡(P0.05);坝上长尾鸡腿肌中的花生四烯酸和二十二碳六烯酸含量显著高于海兰褐鸡(P0.05)。4)坝上长尾鸡胸肌中的镁(P0.01)和铁(P0.05)含量显著或极显著高于海兰褐鸡,腿肌中的钠(P0.05)、镁(P0.01)和铁(P0.05)的含量显著或极显著高于海兰褐鸡。由此可见,坝上长尾鸡和海兰褐鸡的肌肉均品质优良,且坝上长尾鸡肌肉品质优于海兰褐鸡。     

坝上长尾鸡TYR基因核心启动子鉴定与单核苷酸多态性分析

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)作为参与黑色素形成并起调节作用的关键酶,对于动物毛色表型具有重要意义。TYR功能异常会阻断黑色素形成通路,TYR突变会产生白化而导致皮肤、被毛和羽毛呈现白色表型。基因启动子区的转录调控对基因表达具有重要作用。为探明坝上长尾鸡(Gallus gallus)TYR基因启动子活性区及其结构,本研究首先构建了双荧光素酶表达载体,通过脂质体瞬时转染至鸡胚成纤维细胞DF1,利用双荧光素酶检测试剂盒进行启动子活性检测;进而成功克隆了TYR基因5'侧翼区片段1813 bp,构建了7个含有不同长度启动子片段的表达载体(P1~P7)及2个启动子区突变载体(mut-1和mut-2),确定了鸡TYR基因启动子的核心区域为-810~+65,其中-810~-213区域可能存在重要的正向调控元件SP1、Oct-1、GATA-1、C/EBP、SRF、NF-1、YY1、NF-κB、TBP和AP-1的结合位点。通过测序筛选出-963~-957、-955、-932、-692、-391和-321等6个多态位点,利用SHEsis软件预测到8种单倍型:Hap1~Hap8;白羽鸡和黑羽鸡基因型及等位基因频率差异显著(P0.05),白羽鸡的优势基因型分别为BB、DD、FF、II、KK和MM,Hap1频率为100%,黑羽鸡的优势基因型分别为AA、CD、EF、HH、JJ和LL,Hap2频率最高为40%;突变体mut-2的活性值显著低于其对应的非突变体P2,突变体mut-1的活性值显著低于其对应的非突变体P6(P0.05)。上述6个多态位点可能是影响TYR基因启动活性的重要位点,但不是全部的作用位点。启动子活性降低可能影响TYR基因转录,从而影响黑色素合成。本研究探明了坝上长尾鸡TYR基因启动子活性区及其结构,为深入探讨该基因在毛囊组织中的表达调控提供了实验依据。     

赤狐EDNRB基因编码区序列分析及启动子预测

为了研究赤狐内皮素受体B基因(EDNRB)编码蛋白的结构、功能及预测其5′端上游2 000 bp的候选启动子区的核心启动子区与转录因子的结合位点,从NCBI数据库中获得赤狐EDNRB基因的数据,利用生物信息学方法分析其编码区及候选启动子区。结果表明:赤狐EDNRB基因编码氨基酸的总数为443个,编码产物为不稳定的疏水蛋白。二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,存在信号肽和二硫键。该编码蛋白存在于内质网、细胞质膜和线粒体中。该编码蛋白含有7次跨膜G蛋白偶联受体超家族结构域。赤狐与乌苏里貉的亲缘关系最近,与犬关系较近。该基因的5′端上游存在潜在的启动子区域,同时发现存在转录调控元件和转录因子结合位点,不存在CpG岛。通过对赤狐EDNRB基因进行生物信息学分析,能够初步预测其编码区的结构、功能以及该基因的核心启动子区与转录因子结合位点,为其遗传特性及调控机制的研究提供基本信息。     

北极狐CBD103基因序列生物信息学分析及启动子预测

为了研究北极狐CBD103基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、CBD103基因编码蛋白结构及功能,同时探究该基因的表达调控机制,试验通过RT-PCR扩增及测序技术从北极狐皮肤组织中获得CBD103基因cDNA序列,并利用生物信息学方法对所得序列进行预测分析。结果表明:获得序列全长2 327 bp(包括5'侧翼区2 071 bp、CDs区204 bp、3'侧翼区52 bp),编码67个氨基酸残基。北极狐CBD103基因5'侧翼区存在潜在的启动子区域和CpG岛,且发现GC框、TATA框、CAAT框等调控元件及Sp1、Ets、Mef-2、ERE、Myc等多种转录因子。CBD103基因编码的蛋白是定位于细胞核和线粒体的不稳定疏水性蛋白质,此蛋白无规卷曲所占比例较大,使得蛋白构象多样化,主要参与信号转导和转录,存在跨膜区域和信号肽。北极狐与家犬的遗传亲缘关系最近。说明CBD103基因在不同物种间具有一定的保守性,且各物种间亲缘关系与生物进化观点基本一致,同时符合动物分类学。     

水貂TYRP1基因启动子活性和Sp1结合位点

以同源性较高的雪貂TYRP1基因序列(GenBank:NW_004569257.1)为模板,通过PCR扩增7个不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-Basic载体中,利用脂质体转染到A375和293T细胞,通过双荧光素酶检测系统检测活性,利用多个在线软件分别分析启动子区活性及转录因子结合位点,并构建突变体进行活性验证。结果显示:成功构建7个不同长度的启动子缺失片段重组质粒,其中6个片段具有明显的启动子活性。-367/+70区域为水貂TYRP1基因核心启动子区域,-367/-144区域的缺失,启动子活性无明显变化,-144/-37区域的缺失使启动子活性明显下降,表明该区域可能存在正调控元件。通过生物信息学方法预测可能存在Sp1转录因子结合位点,构建的Mut-Sp1-2突变体活性明显低于野生型pGL3-215,差异极显著(P0.01)。结果表明:成功筛选了水貂TYRP1基因核心启动子区域(-367/+70),确定Sp1(-56/-45)结合位点为转录的正调控区域。     

北极狐酪氨酸酶基因cDNA序列分析及启动子预测

为了探明北极狐酪氨酸酶(tyrosine,TYR)基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、基因编码蛋白结构及功能,通过RT-PCR扩增及基因测序技术首次从北极狐皮肤组织中获得TYR基因c DNA序列,全长4 300 bp(包括5'侧翼区2 681 bp,CDS区1 593 bp,3'侧翼区26 bp)。生物信息学分析结果表明:北极狐TYR基因5'侧翼区存在潜在的启动子区域,并发现TATA框和CAAT框等调控元件及髓细胞增生原癌基因(Myc)、胰十二指肠同源盒1(Pdx1)、V-Myb髓细胞组织增生病毒癌基因同源物(Myb)、E26转录因子1(Ets1)、特异性蛋白1(Sp1)和TATA盒结合蛋白(TBP)等多种转录因子。北极狐TYR基因编码蛋白的长度为530个氨基酸残基,编码蛋白是定位于生物膜上的不稳定可溶性亲水蛋白质,该蛋白以无规卷曲为主,主要参与信号转导和转录,存在跨膜区域和信号肽。北极狐与其他物种的系统进化树分析提示北极狐与家犬的遗传亲缘关系最近,不同物种间亲缘关系与生物进化观点基本一致,符合动物学分类。     

银黑狐TYRP1基因CDS区鉴定及生物信息学分析

为了探明酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)基因对狐狸毛色的调控机制,本研究利用RT-PCR、染色体步移和核酸测序等技术,获得了银黑狐TYRP1基因完整编码区(coding DNA sequence,CDS),利用ProtParam和PredictProtein等在线软件对该基因进行了生物信息学分析,并利用Lasergene7.1软件包进行银黑狐与其他物种间的同源性分析及系统进化树的构建。结果表明,银黑狐TYRP1基因CDS区共计1 614bp,编码537个氨基酸残基,属于不稳定可溶性亲水蛋白质。亚细胞定位主要在内质网和高尔基体中,属于分泌蛋白。在第24和25个氨基酸之间存在1个裂解位点,存在信号肽。其属跨膜蛋白,包括跨膜域、胞外域和胞内域3个部分。二级结构以无规则卷曲为主(59.03%),α-螺旋占22.91%,属卷曲蛋白质。三级结构与二级结构预测结果基本一致,主要是由无规则卷曲和α-螺旋构成。银黑狐与其他10个物种间的相似度为88.6%~99.6%,说明物种之间同源性较高,TYRP1基因编码区在进化过程中保守性较强。系统进化分析提示,银黑狐与赤狐和家犬的遗传亲缘关系最近。银黑狐TYRP1基因编码区的成功获取及分析为进一步探讨其在毛色形成过程中的功能研究提供了较好的理论依据。