腺相关病毒分别介导转化生长因子β1和血管内皮生长因子联合转染促进糖尿病皮肤溃疡愈合的生物学效应

目的 探讨腺相关病毒(AAV)介导转化生长因子β1(TGFβ1)和血管内皮生长因子(VEGF)联合转基因治疗促进糖尿病皮肤溃疡愈合的生物学效应.方法 采用四氧嘧啶建立兔糖尿病动物模型,并通过手术方法建立皮肤溃疡创面.将AAV-TGFβ1和AAV-VEGF联合转染糖尿病兔耳皮肤溃疡创面处.通过皮肤溃疡创面愈合大体形态学观测、TGFβ1和VEGF双重免疫组化染色、微循环血管密度显微镜观察计数、主胶原(Ⅰ、Ⅲ型胶原)提取及免疫印迹检测、胶原微量定量检测等方法,研究AAV-TGFβ1和AAV-VEGF联合转基因治疗在促进糖尿病兔耳皮肤溃疡愈合中的生物学效应.结果 AAV-TGFβ1和 AAV-VEGF联合转基因治疗组与对照组皮肤溃疡创面愈合的检测比较发现: (1) 联合转基因治疗组TGFβ1和VEGF基因转录表达增多;(2) 联合转基因治疗组创缘毛细血管叉密度(19.18±3.56)个/mm2高于对照组(6.43±1.52)个/mm2,差别有统计学显著性意义(P＜0.05);(3) 联合转基因治疗组愈合组织中胶原含量均增多(P＜0.05),而且Ⅰ型和Ⅲ型胶原构成比中I型胶原的比例增加.结论 AAV-TGFβ1和 AAV-VEGF可联合高效转染糖尿病兔耳皮肤溃疡创面并有效地促进溃疡愈合.     

腺相关病毒载体介导hTGFβ1、β3体外转染退变腰椎间盘细胞的生物学效应

目的比较研究腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体介导人转化生长因子β1（human transforming growth factor β1,hTGFβ1）与hTGFβ3逆转兔腰椎间盘细胞退变的生物学效应.方法分离、培养兔腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞,并传代建立退变早、晚期细胞模型.采用荧光标记的pSNⅡ型腺相关病毒（pSNAV2）,分别检测其对不同退变程度兔腰椎间盘细胞的转染效率,并在此基础上应用pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3转染不同退变程度的兔腰椎间盘细胞.通过细胞形态、胶原的免疫组织化学染色和35S标记蛋白多糖等方法,检测比较pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3对于退变早、晚期兔腰椎间盘细胞基质合成的影响.结果pSNAV2可高效转染退变早期兔腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞,而对于退变晚期兔腰椎间盘细胞的转染效率低.hTGFβ1和hTGFβ3可显著促进退变早期兔腰椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,其中hTGFβ1的作用较hTGFβ3强.hTGFβ1可促进退变早、晚期兔腰椎间盘纤维环细胞Ⅰ型胶原的合成.hTGFβ3可促进退变晚期兔腰椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原的合成.结论pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3可促进退变早期兔腰椎间盘髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成以及纤维环细胞Ⅰ型胶原的合成,从而延缓和逆转椎间盘退变.对于退变晚期兔腰椎间盘髓核细胞,hTGFβ3可促进Ⅱ型胶原的合成.     

AAV-TGFβ1的构建及其与AV-TGFβ1对髓核细胞蛋白多糖合成影响的比较

目的探讨转化生长因子β1腺相关病毒表达系统(AAV-TGFβ1)的构建及其与转化生长因子β1腺病毒表达系统(AV-TGFβ1)对髓核细胞蛋白多糖合成影响的比较。方法采用PCR技术扩增转化生长因子β1(TGFβ1)基因,并于其两端分别连接EcoRI和SalI酶切位点。将TGFβ1基因亚克隆于腺相关病毒(AAV)载体中,并经酶切和测序分析进行鉴定。AAV-TGFβ1病毒被包装并转染H293细胞,通过免疫荧光检测AAV介导的目的基因表达。利用AAV-EGFP病毒检测AAV对髓核细胞的转染效率。AAV-TGFβ1和AV-TGFβ1分别转染髓核细胞后,通过Antonopulos法检测蛋白多糖的合成。结果测序分析证明TGFβ1序列与NCBI Gene Bank所报道的一致。经酶切鉴定证实AAV-TGFβ1重组质粒被成功构建。AAV可介导TGFβ1高效表达并高效转染髓核细胞。AV-TGFβ1可快速一过性地促进髓核细胞蛋白多糖合成,而AAV-TGFβ1可稳定促进蛋白多糖合成。结论AAV-TGFβ1病毒被成功构建并可稳定地促进髓核细胞蛋白多糖的合成。     

空心钉结合钢缆内固定治疗髌骨横形骨折

自2006年10月至2008年12月,笔者应用空心钉及钢缆内固定治疗髌骨横形骨折56例,疗效满意,现总结报告如下。     

生长激素-海藻酸钠-壳聚糖微胶囊的制备及药物释放性能研究

目的 研究生长激素-海藻酸钠-壳聚糖微胶囊的制备及其释放性能. 方法 本课题采用脉冲电场法制备生长激素-海藻酸钠-壳聚糖微球.根据单因素试验和正交试验结果,优化工艺条件和处方组成.观测其形态、尺寸,鉴别其组分,测定生长激素含量、包封率和回收率,并进行体内、外释放实验. 结果 选择450μm锐孔直径、2cm液面距、1.5%海藻酸钠浓度、8ml/h推进速度、2%Ca2+浓度作为最佳工艺条件.光学显微镜观察可见得到的微胶囊具有很好的圆形形态,平均粒径尺寸为47.93μm.微胶囊的平均包封率为94%,他莫昔芬平均含量为11.24%.体外模拟胃液中,微球不溶胀而且所载生长激素基本不被释放;在模拟肠液中,微球溶胀而且所载生长激素被缓释出来,并且在12h后被完全释放出来.体内实验证实生长激素微球组的血药浓度在8h时到达峰值(98.59ng/ml).体内、外释放证实能够达到延缓释放的目的. 结论 生长激素-海藻酸钠-壳聚糖微球具有良好的圆形形态和较好缓释效果.     

跟骨内侧定位载距突螺钉导向器的研制与初步评价

目的　探讨从跟骨内侧定位、经载距突置入导向针后,由跟骨外侧壁置入载距突螺钉的可行性及精确度,为临床手术方案设计及导向器械的研发改进提供参考依据。 方法　选取10具20侧成人尸体标本,在跟骨外侧做“L”形延长切口,暴露跟骨外侧结构及距下关节,采用自主研发的“跟骨内侧定位载距突螺钉导向器”辅助载距突螺钉置入。首先,从内侧将“定位针”置入距下中关节,将导向器“内侧臂”的“定位孔”套牢定位针,调整“内侧臂”使“导向通道”位于载距突中心,安装“外侧臂”与“手柄”固定。调整“外侧臂”位置,经“导向通道”从内向外穿入跟骨一枚“导向针”,C臂透视提示“导向针”位置理想后,自跟骨外侧壁沿“导向针”用空心钻钻孔,测深后拧入合适的载距突螺钉。最后行CT扫描,利用CT图像评估置入螺钉的精确度。过程中采集相关数据,评估导向器的功能。 结果　肉眼观察标本,所有的导向针位于载距突内,其中65%位于载距突中心,25%偏下方,10%偏后方。在内侧,75%的导向针穿过胫后肌腱,15%位于胫后肌和趾长屈肌腱之间,10%穿经趾长屈肌腱上1/3。在外侧,导向针出针点与跟骰关节的距离为（38.03±5.60）mm,与后关节面的距离为（15.01±3.38）mm,螺钉平均长度为（44.80±3.59）mm。CT扫描图像可见,所有螺钉位于载距突内,有2例穿透上方骨皮质,无螺钉穿出载距突下方、前方及后方骨皮质。 结论　采用跟骨内侧定位法,在自主设计的导向器引导下,可提高载距突螺钉置入的准确性,降低螺钉进入关节、跟骨内侧皮质等并发症。     

骨水泥和骨水泥技术在人工髋关节置换中的临床应用价值及其原理

髋关节置换已经是临床上非常遍采用的手术,早期骨水泥技应用导致较高的静脉血栓及假体松动等副作用的发生率.至今,第1代骨水泥技术已逐步完善发至目前的第3代骨水泥技术并在临床运用中取得可喜的结果.笔者结合骨水泥的特点、骨水泥固定的原理、骨水泥技术的原理,以及骨水泥的临床使用价值等方面进行综合讨论.     

AAV-TGFβ3的构建及其与AV-TGFβ1表达系统对反分化髓核细胞蛋白多糖合成的影响

目的:比较转化生长因子(TGF)β3腺相关病毒(AAV-TGFβ3)与TGFβ1腺病毒(AV-TGFβ1)表达系统对反分化早、晚期髓核细胞蛋白多糖合成的生物学效应。方法:制备具有感染活性的AAV-TGFβ3并采用酶切电泳和免疫荧光对其进行鉴定。将AAV-TGFβ3和AV-TGFβ1分别转染反分化早、晚期髓核细胞,采用免疫印迹法检测TGFβ3和TGFβ1蛋白的表达,并通过Antonopulos法分别检测AAV-TGFβ3和AV-TGFβ1对蛋白多糖合成的生物学效应。结果:AAV-TGFβ3转染可提高反分化早、晚期髓核细胞TGFβ3蛋白的表达,并促进其蛋白多糖的合成。转染后第12天,蛋白多糖含量达到峰值,分别为0.399±0.029和0.152±0.011,此后蛋白多糖含量缓慢降低;于转染后第2个月,蛋白多糖含量稳定在较高水平,分别为0.309±0.021和0.115±0.009。AV-TGFβ1转染亦可提高反分化早、晚期髓核细胞TGFβ1蛋白的表达,但其仅促进反分化早期髓核细胞蛋白多糖的合成,转染后第10天蛋白多糖含量达到峰值(0.413±0.041),此后蛋白多糖含量快速降低,转染后第2个月时蛋白多糖含量降至较低水平(0.198±0.013);对于反分化晚期髓核细胞,AV-TGFβ1则抑制其蛋白多糖的合成。结论:AAV-TGFβ3可稳定地促进反分化早、晚期髓核细胞蛋白多糖的合成;AV-TGFβ1仅一过性地促进反分化早期髓核细胞蛋白多糖的合成,而且抑制反分化晚期髓核细胞蛋白多糖的合成。     

腺相关病毒介导转化生长因子β1和血管内皮生长因子联合转染促进糖尿病溃疡愈合的生物学效应

背景:糖尿病患者溃疡创面难愈合,目前认为是由糖尿病患者创面微循环障碍以及内源性生长因子含量降低等因素所造成。目的:观察腺相关病毒介导转化生长因子β1(AAV-TGFβ1)和血管内皮生长因子(AAV-VEGF)联合转基因治疗促进糖尿病皮肤溃疡愈合的生物学效应。设计:随机对照动物实验。单位:青岛大学医学院和青岛大学医学院附属医院。材料:实验于2004-07/2006-01在青岛大学医学院附属医院妇科实验室进行。选用成年健康大白兔24只,单纯随机分为联合转基因组和对照组各12只。方法:①采用耳缘静脉注入四氧嘧啶(130mg/kg)建立糖尿病模型,并通过手术方法建立溃疡创面。②联合转基因组创面局部浸润注射AAV-TGFβ1和AAV-VEGF(9×106/mL病毒颗粒);对照组注射生理盐水。主要观察指标:①术后1个月,通过聚合酶链反应检测愈合组织中转化生长因子β1和血管内皮生长因子基因的转录水平。②术后3周,用微循环显微镜计数创缘毛细血管密度值。③术后6个月通过蛋白凝胶电泳和半干电转移法对Ⅰ、Ⅲ型胶原进行分离及免疫印迹检测。④术后1d,1,2,3周,1,2,3,4,5,6个月时测定溃疡愈合组织中胶原含量。⑤术后观测创面愈合厚度、颜色、质地。结果:24只兔全部进入结果分析。①联合转基因组转化生长因子β1和血管内皮生长因子基因转录表达增多。②联合转基因组创缘毛细血管密度值高于对照组[(19.18±3.56),(6.43±1.52)个/mm2,P<0.05]。③联合转基因组愈合组织中胶原含量均增多(P<0.05),而且Ⅰ型和Ⅲ型胶原构成比中Ⅰ型胶原的比例增加。④在转染后1d,联合转基因组与对照组溃疡愈合组织中的胶原含量接近(P>0.05)。此后,联合转基因组胶原含量均高于对照组(P<0.05)。⑤对照组溃疡愈合明显滞后,愈合质量差。结论:AAV-TGFβ1和AAV-VEGF可联合高效转染糖尿病兔耳皮肤溃疡创面,可使溃疡组织中毛细血管密度明显增多,愈合组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原构成比中Ⅰ型胶原的比例明显提高,并有效地促进溃疡愈合。     

跟骨内侧定位载距突螺钉导向器的研制与初步评价

目的　探讨从跟骨内侧定位、经载距突置入导向针后,由跟骨外侧壁置入载距突螺钉的可行性及精确度,为临床手术方案设计及导向器械的研发改进提供参考依据。 方法　选取10具20侧成人尸体标本,在跟骨外侧做“L”形延长切口,暴露跟骨外侧结构及距下关节,采用自主研发的“跟骨内侧定位载距突螺钉导向器”辅助载距突螺钉置入。首先,从内侧将“定位针”置入距下中关节,将导向器“内侧臂”的“定位孔”套牢定位针,调整“内侧臂”使“导向通道”位于载距突中心,安装“外侧臂”与“手柄”固定。调整“外侧臂”位置,经“导向通道”从内向外穿入跟骨一枚“导向针”,C臂透视提示“导向针”位置理想后,自跟骨外侧壁沿“导向针”用空心钻钻孔,测深后拧入合适的载距突螺钉。最后行CT扫描,利用CT图像评估置入螺钉的精确度。过程中采集相关数据,评估导向器的功能。 结果　肉眼观察标本,所有的导向针位于载距突内,其中65%位于载距突中心,25%偏下方,10%偏后方。在内侧,75%的导向针穿过胫后肌腱,15%位于胫后肌和趾长屈肌腱之间,10%穿经趾长屈肌腱上1/3。在外侧,导向针出针点与跟骰关节的距离为（38.03±5.60）mm,与后关节面的距离为（15.01±3.38）mm,螺钉平均长度为（44.80±3.59）mm。CT扫描图像可见,所有螺钉位于载距突内,有2例穿透上方骨皮质,无螺钉穿出载距突下方、前方及后方骨皮质。 结论　采用跟骨内侧定位法,在自主设计的导向器引导下,可提高载距突螺钉置入的准确性,降低螺钉进入关节、跟骨内侧皮质等并发症。