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目的:获得人Ⅱ型囊泡单胺转运体(vesicular monoamine transporter-2,VMAT2)基因,转染至MN9D细胞,通过检测细胞内外单胺类递质含量的变化评价VMAT2基因促进单胺类递质循环利用的效应。方法:从人胎脑中提取总RNA,RT-PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重组于pGEM—Easy-T载体中,进行全序列测定。重组真核表达载体pBK-RSV-VMAT2,转染MN9D细胞,免疫细胞化学检测VMAT2的表达,HPLC检测细胞内外单胺类递质含量的变化。结果:RT-PCR扩增到1637bp的带有Kozak序列的eDNA片段。原位杂交证实pAAV-VMAT2能在COS7细胞表达;免疫组化证实转基因的MN9D细胞(实验组)、MAT2免疫着色明显高于对照组。HPLC结果表明实验组中细胞内外的多巴胺含量分别升高至(227.2&;#177;20.8)%和(302.6&;#177;15.7)%(P&;lt;0.01),而细胞外HVA、DOPAC分别降低至(48.1&;#177;5.3)%和(55.7&;#177;4.9)%(P&;lt;0.05),细胞内HVA,DOPAC分别升高至(332.1&;#177;28.2)%和(1176.8&;#177;82.5)%(P&;lt;0.01)。结论:克隆了VMAT2cDNA片断,可在真核细胞中表达。该基因的过表达可促讲多巴胺的循环利用.有望用于帕余森病的基因治疗。 相似文献
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目的研究反转录病毒介导的绿色荧光蛋白(EGFP)基因和酪氨酸羟化酶(TH)基因在原代培养的骨髓基质细胞(bMSCs)中的表达情况。方法体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs,原代培养8~10 d后,同时利用含EGFP和TH基因的反转录病毒上清依次转染bMSCs并进行抗性筛选,7~10 d可得到稳定表达EGFP的bMSCs,在稳定转染EGFP后10 d进行TH病毒上清的转染,7~10 d可得到稳定表达TH和EGFP的bMSCs。结果原代培养bMSCs 3~4 d后生长至70%~80%汇合,病毒转染EGFP后第2天,细胞呈现弱荧光,经G418筛选2~3 d后出现阳性细胞,约8~10 d生长融合,阳性率60%~70%,第2~5代阳性细胞比率无明显变化。TH阳性率也达60%以上。结论利用反转录病毒载体可有效地将EGFP和TH基因转至bMSCs中,并能在体外稳定表达传代。这种表达EGFP和TH的bMSCs对于研究bMSCs的体内迁移分化及帕金森病(PD)的基因治疗具有重要意义。 相似文献
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大鼠骨髓基质细胞在脑内的迁移和分化 总被引:2,自引:1,他引:1
目的研究骨髓基质细胞(bMSCs)在大鼠脑内的迁移和分化情况。方法体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs,原代培养8~10 d后,同时用含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒上清转导bMSCs并进行抗性筛选,7~10 d可得到稳定表达EGFP的bMSCs,然后将EGFP标记的bMSCs通过侧脑室和尾静脉2种注射方式分别注入纹状体损伤的大鼠体内,进而观察bMSCs向脑内迁移和分化的情况。结果在移植后的大鼠脑内均观察到2种方式植入大鼠体内的bMSCs,这些EGFP阳性的细胞呈现出一些神经元和神经胶质细胞的形态并能表达一些神经元和神经胶质细胞的特异性标志物。结论骨髓基质细胞中确实含有能够向神经元方向分化的干细胞。 相似文献
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为了检测单侧注射MPTP制备的帕金森病恒河猴模型纹状体内多巴胺及其代谢产物的含量变化,本研究采用脑内微透析技术和高效液相色谱- 电化学方法检测了双侧尾状核头部多巴胺及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸和高香草酸的含量。结果证明,MPTP注射侧与注射对侧相比,多巴胺、3,4-二羟基笨乙酸和高香草酸的含量分别降低85.7% , 95.1% 和67.8% 。这与动物呈现单侧帕金森病症状,核磁共振检查显示单侧黑质区域密度减低、面积缩小以及经抗酪氨酸羟化酶免疫组化方法显示脑切片单侧多巴胺能神经元明显减少等现象一致。以上结果表明,脑内微透析技术是活体检测脑内神经递质含量变化的有效方法,可以反映模型的病程变化,可用于评价帕金森病的治疗效果。 相似文献
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采用异丙肾上腺素造成大鼠急性心肌缺血模型 ,观察葛根素对大鼠心电图、血清磷酸肌酸激酶 (CPK)、心肌组织超氧化物歧化酶 (SOD)和脂质过氧化物丙二醛 (MDA)的影响。发现葛根素可对抗异丙肾上腺素所致心肌缺血大鼠的心电图ST段的异常升高 ,使血清CPK降低 ,并可增加心肌组织SOD的活力 ,减少MDA生成。提示 :葛根素对大鼠心肌缺血有保护作用 相似文献
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目的获得人Ⅱ型囊泡单胺转运体(vesicular monoamine transporter-2,VMAT2)基因,转染至MN9D细胞,通过检测细胞内外单胺类递质含量的变化评价VMAT2基因促进单胺类递质循环利用的效应.方法从人胎脑中提取总RNA,RT-PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重组于pGEM-Easy-T载体中,进行全序列测定.重组真核表达载体pBK-RSV-VMAT2,转染MN9D细胞,免疫细胞化学检测VMAT2的表达,HPLC检测细胞内外单胺类递质含量的变化.结果RT-PCR扩增到1 637 bp的带有Kozak序列的cDNA片段.原位杂交证实pAAV-VMAT2能在COS7细胞表达;免疫组化证实转基因的MN9D细胞(实验组)vMAT2免疫着色明显高于对照组.HPLC结果表明实验组中细胞内外的多巴胺含量分别升高至(227.2±20.8)%和(302.6±15.7)%(P<0.01),而细胞外HVA、DOPAC分别降低至(48.1±5.3)%和(55.7±4.9)%(P<0.05),细胞内HVA,DOPAC分别升高至(332.1±28.2)%和(1 176.8±82.5)%(P<0.01).结论克隆了VMAT2cDNA片断,可在真核细胞中表达.该基因的过表达可促进多巴胺的循环利用,有望用于帕金森病的基因治疗. 相似文献
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目的制备重组人源半乳糖凝集素1(rhgalectin-1),并研究其对受损神经元自噬水平的促进作用。方法利用PCR技术构建pEGX-4T-1-galectin-1原核生物蛋白表达质粒,构建工程菌。收集rhgalectin-1蛋白,并进行纯化及纯度鉴定。用细胞毒性物质鱼藤酮(rotenone)处理神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系,检测在有无rhgalectin-1预处理的情况下自噬标志物LC3Ⅱ以及p62的水平,分析不同组别细胞的自噬水平。结果成功制备了具有生物学活性的rhgalectin-1,发现rhgalectin-1可降低鱼藤酮对SK-N-SH细胞的毒性作用。鱼藤酮处理SK-N-SH细胞后,其自噬水平有所降低。表现为LC3Ⅱ水平明显降低以及p62水平明显增加(P0.05)。而rhgalectin-1预处理组细胞自噬水平明显增加,LC3Ⅱ水平明显升高,p62水平明显降低(P0.05)。当用自噬阻断剂bafilomycin阻断自噬体降解后,可观察到rhgalectin-1预处理并给予鱼藤酮刺激组较单独鱼藤酮刺激组LC3Ⅱ水平明显增加(P0.05),此现象说明了rhgalectin-1处理的确增强了自噬水平而不是抑制自噬体的降解。结论 rhgalectin-1可以增强神经元的自噬水平,这一特性可能在神经元的毒性抵抗以及损伤后修复过程中发挥重要作用。 相似文献
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[摘要] 目的:探讨PINK1基因对多巴胺合成的调节作用。方法:用高压液相色谱(HPLC)电化学方法检测多巴胺(Dopamine,DA)含量,用蛋白印迹法(Western blots)和Real-Time PCR法检测DA合成限速酶酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)和多巴脱羧酶(dopa decarboxylase, DDC)的表达量,通过免疫共沉淀(Co-immunopricipitation, Co-IP)和免疫组织染色的方法观察PINK1和TH之间是否存在相互作用。结果:PINK1基因敲减后,细胞内DA水平为5.356±0.536ng/ml显著低于对照组的11.63±1.559ng/ml(p<0.05),TH mRNA和蛋白的表达分别为0.3713±0.1403 和0.1956 ±0.06212,显著低于control组的1.009±0.1528和0.3861±0.04455(p<0.05), DDC mRNA和蛋白的表达分别为0.3963±0.1241和0.1492 ±0.02940,显著低于control组的1.100±0.07042和0.3231±0.03758(p<0.05);免疫荧光化学检测PINK1和TH存在共定位,Co-IP显示PINK1和TH存在相互作用。结论:PINK1可以通过调控DA的合成酶TH和DDC的表达影响DA的合成。 相似文献