梅毒螺旋体多表位抗原的改构及在双抗原夹心检测梅毒抗体中的应用

[目的]研制用于包被和标记重组梅毒螺旋体表位抗原，建立双抗原夹心酶联免疫检测梅毒抗体。[方法]利用计算机Godlkey软件分析梅毒螺旋体基因，确立优势抗原表位(rTpN17-TpN15-TpN42-TpN47)，并分别克隆表达四个抗原，然后将四个抗原串联成一个嵌合表达蛋白用于包被，在此抗原的末端连接4个赖氨酸，作为辣根过氧化物酶标记用梅毒抗原，建立双抗原夹心检测梅毒抗体。[结果]在一端连接4个赖氨酸梅毒抗原活性高于未加赖氨酸的抗原，梅毒抗原标记辣根过氧化物酶的ELISA双抗原夹心法与TPHA法阳性符合率为97．5％，特异性明显好于TRUST、间接ELISA法。[结论]改进的梅毒抗原标记辣根过氧化物酶用于双抗原夹心检测梅毒抗体获得了满意的结果。     

检测结核抗体IgM在结核病早期诊断中的应用

[目的]基于多表位结核分枝杆菌嵌合抗原,建立抗结核抗体IgM检测试剂,并探讨在结核病早期诊断中意义。[方法]克隆表达多表位结核分枝杆菌嵌合抗原包被酶联板,抗人IgM单抗标记HRP,建立间接免疫酶联法检测结核抗体IgM,结核抗体IgG同时检测51例结核病人血清样品,两者检测结果进行比较。[结果]51例结核病人血清抗IgG、IgM抗体分别检测率为70．58％（36／51）,43．13％（22／51）,其中10例结核抗体IgG阴性,IgM抗体为阳性。46例健康人血清样品IgM抗体检测2例阳性,特异性95．7％（2／46）。[结论]结核抗体IgM检测在结核病早期诊断中具有一定意义,可作为结核抗体IgG的补充实验,抗IgG、IgM抗体同时检测可提高检测的灵敏度。     

埃博拉病毒NP抗原表位区段的克隆和表达

目的分析埃博拉病毒核蛋白（ NP）抗原表位,克隆表达埃博拉病毒NP抗原,为免疫学诊断试剂的研究奠定基础。方法采用BioSun生物学软件预测分析埃博拉病毒NP抗原的氨基酸表位区间,采用大肠杆菌优势密码子反向翻译成基因序列,采用PCR退火合成法合成NP优势密码子抗原基因,并利用载体pBVIL1进行克隆表达。采用间接ELISA技术评价获得NP抗原的特异性。结果确定埃博拉病毒NP抗原的氨基酸表位位于360～739 aa,共设计36条引物,扩增合成1140 bp的NP抗原基因,克隆表达后,融合蛋白相对分子质量为58×103,测序结果显示插入的NP基因正确。初步结果显示,NP抗原的特异性为99．24％（130／131）。结论获得埃博拉病毒NP抗原,为进一步研制特异的埃博拉病毒快速诊断试剂提供了抗原储备。     

人ZnT8抗原在1型糖尿病诊断中的初步应用

目的构建人锌转运子ZnT8基因N末端、C末端和N-C融合区段的原核表达载体,诱导表达获得重组蛋白,并初步验证各抗原在1型糖尿病ZnT8自身抗体检测中的价值。方法应用RT-PCR方法调取目的基因,构建相应的原核表达质粒,转化大肠杆菌E.coli HB101,诱导表达获得纯化重组蛋白,并作为抗原包被酶联板,初步建立检测ZnT8自身抗体的ELISA方法 ,评价各基因片段在1型糖尿病诊断中的价值。结果获得了3种可被1型糖尿病患者血清识别的重组人ZnT8抗原区段,其中C末端区段ZnT8（268-369aa）与其它两个片段相比具有更高的检测敏感性和特异性,成为首选的抗原区段。结论所选重组人ZnT8（268-369aa）抗原区段具有良好的抗原性,可作为1型糖尿病患者辅助诊断试剂的候选抗原。     

丙型肝炎病毒优势表位抗原不同嵌合表达蛋白的血清反应性研究

目的采用含HCV不同优势表位抗原进行连接表达,对20份血清进行对比检测,探讨血清反应性.方法构建原核融合表达载体pBVIL-1,精选出HCV主要表位抗原插入表达载体在E.coli中表达,纯化后的融合抗原包被酶联板,用ELISA方法进行测定.结果不同抗原组合连接(HCV NS4-Core、NS4-Core-NS3、NS4-Core-NS5AB-NS3)对血清的反应性不同.结论含有多个抗原表位的嵌合抗原,能提高检测的灵敏度.     

重组人胰岛素原的克隆表达及其在1型糖尿病检测中的初步应用

目的 构建人胰岛素原原核表达载体,诱导表达获得重组蛋白,并初步验证重组人胰岛素原在1型糖尿病胰岛素自身抗体检测中的价值.方法 采用PCR逐步合成法获得目的 基因,构建原核表达质粒pBVIL1/INS,转化大肠埃希菌E.coli HB101,诱导表达获得纯化重组蛋白,用重组蛋白作为包被抗原,初步建立检测胰岛素自身抗体的ELISA方法.结果 获得了可被1型糖尿病患者血清识别的重组人胰岛素原.以重组人胰岛素原作为包被抗原初步建立的ELISA方法,其敏感度和特异度分别为54.5%和100%.结论 重组人胰岛素原具有良好的抗原性,可作为1型糖尿病患者辅助诊断试剂的候选抗原.     

结核分支杆菌Mtb8、Mtb8．4和Mtb16．3抗原的基因克隆、表达及在血清诊断中的应用

[目的]克隆Mtb8、Mtb8．4和Mtb16．3：二种结核分支杆菌抗原的基因，利用大肠杆菌表达系统分别表达重组蛋白，分析纯化并初步评价其抗原性。[方法]通过PCR方法从结核分支杆菌菌株H37Rv基因组中扩增Mtb8、Mtb8．4和Mtb16．3基因，连接入pBVIL1表达载体，在大肠杆菌菌株HB101中进行表达，蛋白纯化后通过间接ELISA方法初步评价其抗原性。[结果]获得了结核分支杆菌抗原Mtb8、Mtb8．4和Mtb16．3的基囚，并存大肠杆菌中进行了高效表达，初步验证所获得的纯化抗原具有良好的抗原性。[结论]通过pBVIL1表达载体高效表达的结核分支杆菌抗原Mtb8、Mtb8．4和Mtb16．3抗原均可作为结核病血清学诊断的候选抗原。     

丙型肝炎病毒抗体（双抗原夹心）与HCV-IgM检测试剂性能对比研究

[目的]对研制的丙型肝炎病毒抗体（双抗原夹心）与HCV—IgM检测试剂进行对比，探门丙型肝炎病毒感染早期诊断意义。[方法]收集早期丙型肝炎病毒感染的样品43份，慢性丙肝患者27份，应用建立的丙型肝炎病毒抗体（双抗原夹心）及HCV—IgM检测试剂同时对比检测。[结果]建立的丙型肝炎病毒抗体（双抗原夹心）检测试剂与HCV—IgM对早期丙型肝炎病毒感染样品及慢性患者检出符合率均为100％，而间接抗HCV检测试剂在早期感染样品有1份检测阴性。[结论]建立的丙型肝炎病毒抗体（双抗原夹心）可同时检测抗HCV-IgG和IgM，抗HCVIgM在早期检测的抗体滴度高于慢性感染者。     

人羧基肽酶H不同区段抗原的克隆表达及其初步应用

目的 构建人羧基肽酶H不同区段抗原的原核表达载体,诱导表达获得重组蛋白,初步验证人羧基肽酶H不同抗原区段在羧基肽酶H自身抗体检测中的应用价值。方法 应用RT-PCR方法调取目的基因,构建相应的原核表达质粒,转化大肠埃希氏菌诱导表达重组蛋白,用重组蛋白作为包被抗原建立人羧基肽酶H自身抗体的间接ELISA方法,评价羧基肽酶H抗原在检测新诊断2型糖尿病患者抗羧基肽酶H自身抗体中的应用价值。结果 获得了羧基肽酶H三种不同区段抗原,其中42～476氨基酸区段为较理想的抗原。以该全长抗原作为包被抗原检测95例新诊断2型糖尿病患者,羧基肽酶H自身抗体阳性率为8.42%。结论 原核克隆表达的人羧基肽酶H 42～476氨基酸区段抗原具有良好的抗原性,可作为成人隐匿性自身免疫性糖尿病鉴别诊断的候选抗原。     

HCV NS5A-B片段的表达及在酶活性研究中的应用

目的：利用原核表达载体pBVIL1，表达丙型肝炎病毒非结构蛋白（NS3）丝氨酸蛋白酶催化底物NS5A—B小分子，为进一步研究蛋白酶活性提供方法学。方法：将PCR合成的NS5A—B（2412—2427aa）基因直接插入高效原核表达载体pBVIL1，融合表达NS5A—B片段．包涵体形式的表达产物用8mol／L脲溶解后，采用离子交换和凝胶过滤两步纯化。利用SDS—PAGE、Western blot和ELISA方法，于37℃酶催化条件下，分析NS5A—B底物的降解活性。结果：（1）构建了pBVIL1／NS5A—B重组质粒，鉴定证明NS5A—B基因片段正确地插入表达载体上：融合蛋白在转化质粒的HB101菌中得到高效表达。分离纯化重组蛋白后浓度可达0．73g／L。（2）在NS3蛋白酶作用不同时间后，用SDS—PAGE和Western blot证实，底物带可被明显降解，ELISA分析也证明，NS5A—B具有酶底物活性。结论：含有酶切位点的NS5A—B融合蛋白可被NS3丝氦酸蛋白酶有效地降解，可用作为NS3蛋白酶的底物，可替代全长NS5A—B和化学合成肽用于酶活性和酶阻断剂的研究