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痘病毒是自然界普遍存在的DNA病毒,能够高效表达外源基因,诱导较强的细胞免疫和体液免疫,受到基因治疗学者的广泛关注。痘病毒发生同源重组的概率较低,所以有效地筛选和纯化痘病毒十分重要。目前常用的筛选重组痘病毒方法有基于CRISPR进行筛选;根据报告基因GFP、LacZ、GPT等进行筛选;利用TK-和Brdu结合荧光进行筛选;利用药物抗性基因与荧光或显色基因融合,即可在药物筛选的同时观察荧光或显色基因表达情况。本文旨在对目前常用的痘病毒的筛选纯化方法进行综述。 相似文献
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目的在体外构建携带CCL5和SSTR2双基因的重组溶瘤痘病毒,并初步检测其溶瘤活性。方法利用基因工程策略,分步构建重组痘病毒真核表达质粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+;经同源重组痘病毒Western Reverse(WR)株和23轮筛选纯化后,获得纯化的重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+;经扩大培养及浓缩纯化后获得高滴度的重组溶瘤痘病毒,用ELISA和Western blot分别验证感染重组溶瘤痘病毒的HeLa细胞CCL5和SSTR2的表达变化;用CCK-8法检测了rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对两株肿瘤细胞系的杀伤活力。结果成功构建了重组痘病毒真核表达质粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+;经同源重组、筛选纯化和浓缩后,获得滴度为9.4×10^8 PFU/mL的重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+;ELISA和Western blot结果表明,HeLa细胞感染rVV-CCL5-SSTR2-Luc+后,其CCL5和SSTR2蛋白表达水平显著高于对照组rVV-Luc+(分别为P<0.05和P<0.01);CCK8结果表明,rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对人胚肾上皮细胞HEK293T杀伤活力极低,而rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对两株肿瘤细胞系的杀伤活力均随感染时间逐渐增强。并且rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对肿瘤细胞的杀伤活力较之对照组rVV-Luc+均显著升高(HCT116:感染48 h时P<0.05;Hela:感染48 h时P<0.05,72 h时P<0.01)。结论本研究成功构建并获得了纯化的重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+,并初步验证了其杀瘤活性,为开展后续体内外实验奠定了实验基础。 相似文献
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