结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16．3蛋白的原核表达及功能检测北大核心CSCD

目的进行结核分枝杆菌小分子热休克蛋白MTB Hsp16.3原核表达载体的构建、表达、纯化并初步观察其生物学效应。方法提取临床H37Rv分离株基因组DNA,PCR扩增Hsp16.3基因,将其重组到原核表达载体Pet28a中,构建原核表达载体Pet28a-Hsp16.3,进行双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE检测,同时通过镍柱纯化试剂盒纯化Hsp16.3,测定纯化后蛋白浓度,并进行Western blot法检测。将不同浓度纯化后蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞IL-10和IFN-γ的表达,同时设定空白对照组及阳性对照组。结果成功构建重组质粒Pet28a-Hsp16.3,并在E.coli BL21(DE3)中获得成功表达,通过镍柱纯化系统得到纯化Hsp16.3融合蛋白。qRT-PCR检测结果显示,不同浓度纯化后Hsp16.3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,可促进IFN-γ的产生而抑制IL-10的产生。结论成功克隆、表达和纯化了MTB Hsp16.3蛋白,Hsp16.3能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-γ,抑制IL-10的产生。     

Toll样受体信号介导细胞凋亡的研究进展

细胞凋亡在病毒、细菌等感染的过程中和肿瘤等疾病的发生发展中起至关重要的作用。Toll样受体(TLR)存在于巨噬细胞、肿瘤细胞等细胞表面,能直接识别并结合病原微生物和宿主细胞表面的病原相关分子模式,然后通过髓样分化因子88/Fas相关死亡结构域/caspase-8、TIR结构域接头蛋白/蛋白激酶/干扰素调节因子和核因子κB路径等信号途径对巨噬细胞、肿瘤细胞等细胞的凋亡起调节作用。随着对TLR介导的细胞凋亡中Fas相关死亡结构域、TIR结构域接头蛋白等多种信号分子的深入研究,有助于了解它们在细胞凋亡中的作用,并为感染和肿瘤等疾病的分子靶向治疗提供新的目标。     

实时定量聚合酶链反应在肺结核早期诊断中的价值

目的探讨实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)在肺结核早期诊断中的价值及对结核分枝杆菌检出率较抗酸染色的优势。方法 收集2015年7~8月疑似结核患者痰液标本191份,分别采用RQ-PCR和抗酸染色检测标本中结核分枝杆菌并进行比较。结果 RQ-PCR检测阳性率[27.75%(53/191)]显著高于抗酸染色[9.95%(19/191)],差异有统计学意义(χ2=1.43,P<0.01);RQ-PCR检测灵敏度、约登指数较抗酸染色高,抗酸染色检测特异性较RQ-PCR高,综合各项指标以RQ-PCR较好。结论 RQ-PCR对结核分枝杆菌的检测具有高特异性、灵敏度及快速、简便等特点,在肺结核早期诊断中具有很好的参考价值,可作为诊断肺结核的常规方法,适合在临床推广应用。     

γ-干扰素诱导蛋白-10及其受体CXCR3在结核性胸膜炎患者中的表达和意义

目的:探讨γ-干扰素诱导蛋白-10及其受体CXCR3在结核性胸膜炎患者外周血和胸水中的表达和临床意义.方法:采集30例健康正常者的外周血及30例结核性胸膜炎患者的外周血和胸水,采用流式细胞术检测结核性胸膜炎患者外周血单个核细胞及胸水细胞中的CXCR3的表达;用ELISA法检测结核性胸膜炎患者血清及胸水中IP-10的浓度.结果:结核性胸膜炎患者外周血血清中IP-10的浓度显著高于正常对照组(P＜0.05),患者胸水中IP-10浓度较高,且患者胸水与患者外周血中IP-10水平具有正相关(r=0.572,P＜0.05);结核性胸膜炎患者外周血中CXCR3的表达显著高于正常对照组(P＜0.05),患者胸水细胞中CXCR3的表达较高,且患者胸水细胞与外周血中CXCR3表达具有正相关(r=0.627,P＜0.05)结论:结核性胸膜炎患者血清中IP-10浓度及外周血单个核细胞CXCR3的表达显著升高,提示IP-10及其受体CXCR3是参与结核性胸膜炎发生发展的重要免疫分子,可能与结核性胸膜炎发病机制有关.     

热休克蛋白16.3多克隆抗体的制备

目的大肠杆菌表达Hsp16.3,制备其多克隆抗体。方法设计引物,从H37Rv基因组中扩增出目的片段Hsp16.3,pET28a-Hsp16.3质粒的构建、克隆和表达。对His-Hsp16.3进行诱导、表达和纯化。用纯化好的蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,用ELISA检测抗血清中多抗的效价,用Western blot法检测多克隆抗体的生物活性。结果重组质粒pET28aHsp16.3在E.coli BL21(DE3)中成功表达,SDS-PAGE结果显示在His-Hsp16.3的相对分子质量(Mr)约为20 000。制备的多克隆抗体效价为1∶800,且特异性较好。结论成功的克隆、表达、纯化出His-Hsp16.3,并且成功制备了抗Hsp16.3多克隆抗体。     

人羊膜间充质干细胞外泌体通过微小RNA-135a促进成纤维细胞迁移实验研究

目的研究人羊膜间充质干细胞外泌体(human amniotic mesenchymal stem cell exosome,hAMSCExo)中的微小RNA-135a(microRNA-135a,miR-135a)对成纤维细胞迁移的作用。方法用外泌体分离试剂盒提取hAMSC-Exo并进行鉴定,划痕实验检测hAMSC-Exo对成纤维细胞迁移的作用。实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测过表达miR-135a后hAMSC-Exo中miR-135a基因相对表达量,划痕实验检测过表达和敲减miR-135a后hAMSC-Exo对成纤维细胞迁移的作用,Western blot检测过表达和敲减miR-135a后hAMSC-Exo成纤维细胞迁移相关蛋白[大分子肿瘤抑制因子2(large tumor suppressor 2,LATS2)、E-钙黏着蛋白(E-cadherin)、N-cadherin、α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)]的相对表达量;均以293T细胞外泌体及hAMSC-Exo作为对照。结果成功获得hAMSC-Exo;划痕实验检测示,hAMSC组促进成纤维细胞迁移能力最强,GW4869(外泌体抑制剂)处理hAMSC组促进成纤维细胞迁移能力减弱。qRT-PCR检测示过表达miR-135a后,hAMSC-Exo中miR-135a基因相对表达量明显增加。划痕实验检测示,过表达miR-135a后,hAMSC-Exo促进成纤维细胞迁移能力增强;而敲减miR-135a后,hAMSC-Exo促进成纤维细胞迁移能力减弱。Western blot检测成纤维细胞迁移相关蛋白显示,与293T细胞外泌体组比较,各hAMSC-Exo处理组均下调Ecadherin、N-cadherin和LATS2表达,上调α-SMA表达;其中过表达miR-135a后,hAMSC-Exo能力增强,敲减miR-135a后,hAMSC-Exo能力较过表达miR-135a组下降。结论hAMSC-Exo中的miR-135a可促进成纤维细胞迁移,抑制E-cadherin、N-cadherin和LATS2表达,促进α-SMA表达。     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3蛋白的原核表达及功能检测

目的进行结核分枝杆菌小分子热休克蛋白MTB Hsp16.3原核表达载体的构建、表达、纯化并初步观察其生物学效应。方法提取临床H37Rv分离株基因组DNA,PCR扩增Hsp16.3基因,将其重组到原核表达载体Pet28a中,构建原核表达载体Pet28a-Hsp16.3,进行双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE检测,同时通过镍柱纯化试剂盒纯化Hsp16.3,测定纯化后蛋白浓度,并进行Western blot法检测。将不同浓度纯化后蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞IL-10和IFN-γ的表达,同时设定空白对照组及阳性对照组。结果成功构建重组质粒Pet28a-Hsp16.3,并在E.coli BL21(DE3)中获得成功表达,通过镍柱纯化系统得到纯化Hsp16.3融合蛋白。qRT-PCR检测结果显示,不同浓度纯化后Hsp16.3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,可促进IFN-γ的产生而抑制IL-10的产生。结论成功克隆、表达和纯化了MTB Hsp16.3蛋白,Hsp16.3能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-γ,抑制IL-10的产生。     

负压封闭引流在烧伤创面中的应用研究进展

负压封闭引流(VSD)因能够通过聚氨酯或聚乙烯醇敷料、半透膜、负压引流装置构筑的密闭空间及时充分引流,排出创面分泌物及坏死组织,控制创面感染,加速肉芽组织再生,促进创面愈合,被广泛应用于烧伤创面的治疗,且具有操作简便、疗效可靠等优点。本文主要针对VSD在烧伤创面中的应用研究进展进行综述,以期为VSD在烧伤创面治疗中的进一步完善提供理论依据。     

Gab2在结直肠癌组织中的表达及其意义

目的:探讨Gab2在结直肠癌组织中的表达及其意义。方法:应用免疫组化方法检测78例结直肠癌及46例癌旁正常组织中Gab2的表达水平,并结合临床病理学资料进行统计学分析,Western blot方法检测10对结直肠癌组织及相对应的癌旁正常组织中Gab2的表达状况。结果:免疫组化检测结果显示78例结直肠癌组织中Gab2蛋白表达阳性率为53.85%,而癌旁正常组织中Gab2蛋白多不表达或弱表达,两组结果比较差异有显著性(P0.001);Gab2蛋白在结直肠癌中的表达与肿瘤TNM分期及有无淋巴结转移呈正相关(P0.05),与肿瘤大小、分化程度无明显相关性(P0.05);Western blot检测结果显示结直肠癌组织中Gab2蛋白表达显著高于相对应的癌旁正常组织(P0.05)。结论:Gab2在结直肠癌组织中过表达,可能在结直肠癌的发生发展中起重要作用。