抗哈维氏弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其特性鉴定

目的：研制抗哈维氏弧菌特异性单克隆抗体（mAb）并进行免疫学特性分析。方法：以哈维氏弧菌GYC1108—1颗粒性抗原免疫8周龄雌性BALB／c小鼠，5次免疫后取其脾细胞与Sp2／0-Ag-14骨髓瘤细胞融合。用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）对杂交瘤进行筛选，并鉴定mAb特异性及敏感性。结果：各株阳性克隆经3次亚克隆后，共获得5株抗GYC1108—1的mAb，其中187的细胞上清及腹水效价分别为1：3200和1：32000，交叉反应结果表明187除了与测试的多株哈维氏弧菌发生反应外，还与溶藻弧菌、麦氏弧菌和副溶血弧菌发生免疫交叉反应，但不与拟态弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌等发生交叉反应。ELISA检测187腹水对GYC1108—1的敏感性达10^7／L。结论：制备的抗哈维氏弧菌mAb可为哈维氏弧菌的检测及防治等提供有用的试剂。     

草鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:研制抗草鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体(mAb)并进行免疫学特性分析.方法:制备草鱼免疫球蛋白IgM, 以其为抗原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠, 3～4次免疫后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合, 用ELISA法对杂交瘤进行筛选, 并鉴定mAb的生物学特性.结果:各株阳性克隆经3次亚克隆后, 共获得5株抗草鱼IgM的mAbs, 分别命名为4B3、 2B11、 4D5、 3F2和4E6, 它们的细胞上清ELISA效价为1∶ 3 200～1∶ 6 400, 其中4D5的细胞上清及腹水效价分别为1∶ 6 400和1∶ 256 000, 经亚类鉴定结果表明5株mAb均为IgG1.交叉反应结果表明5株mAb均不与台湾甲鱼、泰国甲鱼、日本甲鱼和中华鳖的血清反应, 除mAb 4B3外, 其余4株均与草鱼、青鱼、鲢鱼、鳊鱼和花鱼骨的血清有明显的交叉反应, 而与鲫鱼、鳗鱼的血清只有微弱的反应.mAb 4B3只与草鱼和青鱼的血清有反应, 而与其他鱼类血清反应很弱.免疫印迹实验结果表明mAb 4D5能在变性条件下识别草鱼IgM的重链.ELISA检测mAb 4D5对草鱼IgM的敏感性达10 μg/L.结论:制备的抗草鱼IgM mAb可用于草鱼免疫球蛋白的结构分析、免疫应答水平监测和病原诊断等, 具有广阔的应用前景.     

鸡白细胞介素-2基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建鸡白细胞介素2(IL-2)真核重组表达质粒,体外鉴定其能否表达。方法:将鸡IL-2cDNA(RT-PCR法获得),克隆入真核高效表达质粒pcDNA3.1( )中,构建pcDNA-IL-2重组表达质粒。PCR和双酶切的方法鉴定克隆的正确性。然后构建pcDNA IL GFP重组表达质粒(即GFP基因与IL2的一段上游基因融合表达),PCR方法鉴定克隆的正确性。脂质体法转染COS1细胞,荧光显微镜下观察荧光。结果:正确构建了真核重组表达质粒pcDNA-IL2和pcDNA-IL-GFP。荧光显微镜下可观察到很强的绿色荧光。结论:鸡IL-2克隆和表达成功。为下一步用重组质粒pcDNA-IL2免疫BALB/c小鼠,研制鸡IL-2单克隆抗体奠定了基础。     

草鱼出血病灭活疫苗上调草鱼脾细胞主要免疫分子的表达

目的探讨草鱼出血病灭活疫苗对草鱼脾脏中Ig M、主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)、1型干扰素(IFN1)、补体3(C3)、白细胞介素1β(IL-1β)、内凝集素(intelectin)相关基因表达的影响。方法用草鱼肾细胞系(CIK)培养草鱼呼肠孤病毒(GCRV),并制备草鱼出血病灭活疫苗,用生理盐水稀释成50倍和100倍,包括未稀释组及生理盐水对照共4组。分别腹腔免疫注射健康草鱼,各组分别于免疫后0、6、12、24、72 h,取脾脏并抽提总RNA,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测上述6种免疫相关基因mRNA表达。结果与生理盐水对照组相比,免疫注射不同剂量的草鱼出血病灭活疫苗均能刺激草鱼脾脏中6种主要免疫分子不同程度的表达上调,表明疫苗刺激草鱼机体启动了非特异性和特异性免疫应答。在3个疫苗免疫组中,intelectin、MHCⅠ、IL-1β、C3基因的相对表达量都随着时间的推移出现先表达上调,后表达下调;基因IFN1的相对表达量在免疫后6 h达到峰值,之后下降至正常水平;Ig M的相对表达量在所检测时间内呈逐渐上调的趋势。结论草鱼出血病灭活疫苗均能诱导草鱼脾脏中免疫相关分子基因的表达上调。