真核表达人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法

目的 真核表达人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,SV)融合蛋白(fusion protein,),并完成蛋白纯化及纯度测定.方法 根据编码F蛋白的基因序列设计引物,CR方法扩增出3'端带His标签的F基因序列,克隆入pGEM-T-easy载体,经核酸序列分析后,进一步克隆到pcDNA3.1( )真核表达载体,限制性内切酶鉴定,用脂质体Lipofectamine2000转染COS-7细胞,2 h后再用Westem blot检测目的蛋白的表达.Ni柱亲和层析纯化COS-7细胞表达的F蛋白,高效毛细管电泳分析纯化后蛋白纯度.结果 核酸序列分析证实获得带His标签的RSV F基因序列,没有发生无义突变.转染COS-7细胞后,利用Western blot方法检测到F蛋白的特异性条带,纯度达99%以上.结论 初步建立了真核表达RSV F蛋白的纯化方法,为进一步优化RSV F蛋白制备条件及单克隆抗体及诊断试剂等研究奠定了基础.     

人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定

目的 克隆人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）F基因，构建F基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）/F，并进行表达和鉴定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物，通过RT-PCR从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得F蛋白的基因，然后克隆到pGEM-3zf载体中，序列测定正确后，将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋），行酶切鉴定，脂质体法转染COS-7细胞，应用Western blotting方法分析F基因表达情况。结果测序证实得到HRSVF基因序列，序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后，利用Western blotting方法检测到了F蛋白的特异性条带。结论成功克隆HRSVF基因，并在真核细胞中获得表达。     

一起由水污染引起的儿童及成人A组轮状病毒腹泻暴发

目的 确定2006年11月广西大新县大范围腹泻暴发性流行的病原及其分子生物学特点.方法进行流行病学个案调查和粪便标本的实验室检测,用ELISA试剂盒进行A组轮状病毒的检测,对检测阳性标本进行轮状病毒分型并对其中4份检测阳性轮状病毒的vfy7全基因扩增.结果 采集的64份腹泻患者粪便标本中共有30份检测为轮状病毒阳性,总阳性率为46.9%,此次暴发的流行病学和临床特征也符合轮状病毒腹泻特征,RT-PCR进行G/P分型显示为G1P[8]型轮状病毒,VP7氨基酸显示第68位氨基酸改变.结论 G1P[8]型A组轮状病毒是此次腹泻暴发的病原.值得注意的是,此次A组轮状病毒暴发累及儿童和成人.     

T7 RNA聚合酶的克隆及其介导基因转录功能的鉴定

目的构建含T7RNA聚合酶(T7RNA Polymerase,T7RNP)的真核表达载体,同时构建含T7启动子、增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)和T7RNP转录终止信号的载体,并通过观察EGFP的表达推测T7RNP表达和T7表达系统介导基因转录的功能。方法根据编码T7RNP的基因序列,应用PCR技术从含有T7RNP基因的E.coli BL21(DE3)基因组中扩增编码T7RNP的基因片段,克隆至载体pcDNA3·1( )。同时从px8δt载体和pGEM-Teasy/EGFP上切下T7RNP识别的终止信号(terminator,TER)和编码EGFP的基因,克隆至载体pcD-NAII。将获得的两个重组质粒共转染BHK细胞。48h后,通过观察EGFP基因在真核细胞内的表达情况,推测T7RNP基因的表达及表达后识别T7启动子介导基因转录功能。结果成功构建了含T7RNP编码基因的真核表达载体pcDNA3·1( )/T7RNP和原核表达载体pcDNAII/EG-FP/TER,共转染BHK细胞后,可观察到EGFP表达的绿色荧光。结论T7RNP能顺利在真核细胞内表达,并通过与T7启动子和TER的相互作用,成功实现了EGFP基因的转录和表达。     

人A组轮状病毒VP6和NSP4编码基因的独立进化

轮状病毒是引起儿童重症腹泻的主要病原.目前,绝大多数研究认为A组轮状病毒的VP6和NSP4基因在进化上紧密联系[1].我们曾报道过一株在世界上极为罕见的人A组轮状病毒GSP[6]毒株[2](LL3354),通过对该毒株的VP6和NSP4全基因的分析,发现LL3354的VP6和NSP4编码基因是通过独立进化而来.     

人双埃可病毒的流行及其疾病相关性

人双埃可病毒(human parechovirus,HPeV)最早于半世纪前被发现,起初被归为肠道病毒属,命名为埃可病毒22和23,但由于基因结构、进化关系及生长特性与肠道病毒属的其他病毒不一样而划分为新的双埃可病毒属,并重新命名为HPeV1与HPeV2[1].随着RT-PCR与病毒发现方法的广泛应用,不同型别的HPeVs陆续被报道.到目前为止,双埃可病毒属已报道包含有16种不同型别的HPeV,而且这一数字很有可能继续增加.不同型别的HPeVs感染后所引起的临床症状不尽相同,目前已有资料显示可能引起胃肠道、呼吸道相对温和的症状,此外,诸如脑炎、心肌炎、弛缓性麻痹、新生儿败血症等致命性症状也有报道.本文将对HPeVs的感染、流行状况与疾病相关性等方面进行相关的综述.     

应用不依赖序列的单引物扩增技术获得人博卡病毒全基因序列

目的 研究通过不依赖序列的单引物扩增（Sequence independent single primeramplification,SISPA）技术获得腹泻标本中人博卡病毒的全基因序列.方法 筛检仅含有人博卡病毒的标本,经过滤、超速离心富集和核酸酶处理后提取病毒核酸,采用SISPA-PCR技术扩增病毒序列,克隆后测序,经比对分析获得人博卡病毒基因序列,再用DNAstar拼接成全基因序列.结果 获得了人博卡病毒4834bp的序列,仅两端少部分序列未得到.结论 SISPA-PCR技术是一种可直接从样品中获得病毒全基因序列的方法.     

腹泻住院患儿中检测到人双埃可病毒

目的 在腹泻住院患儿粪便标本中检测人双埃可病毒(HPeV),探讨HPeV与婴幼儿重症腹泻之间的联系.方法 通过Real-time PCR直接从<5岁未知病原住院腹泻患儿粪便标本中检测HPeV,进而通过基于VP3/VP1连接区的巢式PCR扩增片段的测序结果进行分型.结果 99份腹泻粪便标本,HPeV阳性24例(24%),其中,以HPeV1为主(50%),其次为HPeV3(25%),HPeV4(8.3%),HPeV6(4.2%),还有3例HPeV阳性标本未能分型,未检测到HPeV2、5、7、8.HPeV感染的住院腹泻患儿主要为<1岁患儿.HPeV感染高峰为秋冬季节,10月达到峰值.VP3/VP1连接区基因与已知HPeV的病因构成及深入了解HPeV的病原学及流行病学特点有重要意义.