AFP启动子调控PNP载体的构建及分析

目的分别构建三种启动子调控的大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因表达载体,检测、分析三者的表达差异.方法构建三种启动子调控的PNP基因表达载体.将三个PNP基因载体转染不同细胞株,检测PNP基因在各细胞株中表达,分析三者表达的特点.结果AF 0.3和[HRE]AF调控的PNP基因在AFP阳性肝癌细胞中实现了靶向性表达,而且后者在AFP阴性肝癌细胞中也实现了靶向性表达.结论三种PNP基因表达载体的成功构建为利用PNP/MeP-dR系统进行肝癌的靶向性基因治疗打下坚实的基础.     

PNP—TK融合自杀基因及PNP单自杀基因对肝癌细胞杀伤效率

目的分析PNP—TK融合自杀基因系统及PNP单自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用及二者对肝癌细胞潜在的杀伤机制。方法构建融合基因表达我体pcDNA3．0／PNP—TK。经酶切、PCR及测序鉴定重组体。G418筛选获得稳定转染了pcDNA3．0／PNP-TK的HepG2细胞克隆。RT—PCR和Western Blotting检测融合基因在HepG2细胞中的表达。台盼兰排斥法检测细胞的生长曲线,MTT法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。结果融合基因片段PNP—TK正确插入了pcDNA3．0载体中,pcDNA3．0,PNP-TK在肝癌细胞株HepG2中实现了表达。抗性细胞克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下。pcDNA3．0／PNP-TK所导致的旁观者效应明显强于只给予MeP-dR一种前药以及pcDNA3．0／PNP单基因系统所致的旁观者效应。结论具有双自杀基因功能的表达载体pcDNA3．0／PNP-TK对肝癌细胞的杀伤效果优于PNP单自杀基因系统。     

pcDNA3．0／PNP-CD和pcDNA3．0／PNP表达载体的克隆和表达

目的：构建新型PNP，Mep-dR自杀基因系统的融合和单基因表达载体。方法：利用DNA重组技术制备融合自杀基因PNP-CD．将其和PNP单基因分别插入真核表达载体pcDNA 3．0中，构建融合与单自杀基因表送载体pcDNA 3.0 PNP-CD和pcDNA 3．0 PNP;酶切、PCR及测序鉴定两重组体结果：成功构建了两个新型自杀基因载体并实现在HepG2肝癌细胞株中的表达。结论：两个新型自杀基因表达载体．尤其是I’Nt。CI)融合自杀基因载体．是肿瘤基因治疗中广谱、高效的治疗载体。     

两种甲胎蛋白启动子调控下PNP基因载体的克隆和表达差异性分析

目的：分别构建甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)启动子AF0．3和AFP杂合启动子[HRF]AF调控的PNP基因表达载体，检测并分析两者的表达差异性。方法：将AF0．3和[HRE]AF启动子插入载体pcDNA3．0中，构建肝癌特异表达载体pAF0．3和p[HRE]AF；将PNP基因分别插入pAF0．3和p[HRE]AF中，构建两启动子调控的PNP基因表达载体；通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体。用脂质体介导法将两重组体转染不同细胞株．RT-PCR检测PNP基因在各细胞株中表达，分析两者表达的特点。结果：两目的片段均正确插入相应载体，pAF0．3/PNP中的PNP基因在AFP阳性肝癌细胞中实现了靶向性表达，而p[HRE]AF/PNP中的PNP基因则在AFP阳性和阴性肝癌细胞中实现了靶向性表达。结论：两种PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效、特异性的治疗载体。两者的成功构建为利用PNP Mep-dR系统进行肝癌的靶向性基因治疗奠定了坚实的基础。     

肺癌组织中DNA修复酶MGMT、DNA-PKcs和Ku的表达变化

[目的]检测肺癌组织中DNA损伤修复酶MGMT、DNA-PKcs和Ku的表达变化，探讨其表达和肺癌发生发展及临床病理特征之间的关系。[方法]采用免疫组织化学方法(LSAB法)检测10例肺部良性病变和44例肺癌标本中上述修复酶的表达情况(每一标本同时检测正常及肿块两个部位)。同时还检测了肺癌组织中突变型P53蛋白的表达。[结果]随着肿瘤的进展MGMT的表达可被诱导增强，DNA-PKcs和Ku的表达则降低，三种修复酶在肺肿瘤组织的表达均较良性肺组织低，差异有显著性。DNA-PKcs和Ku的表达具有明显相关性。突变型P53蛋白阳性标本中MGMT蛋白的平均表达得分较P53蛋白阴性标本显著降低。DNA损伤修复酶的表达和病人的年龄、性别、组织学分型、分级无关。[结论]DNA损伤修复酶表达的改变在细胞的恶性转变过程中至少起到了一定的作用，DNA损伤修复酶作为肺肿瘤易感性标志物有一定可行性。     

PNP-TK融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的分析PNP—TK融合自杀基因系统对HepG2肝癌细胞的杀伤作用及其对肝癌细胞的杀伤机制。方法利用重组PCR定点诱变法制备PNP—TK融合基因,将其插入真核表达载体pcDNA3．0中,构建融合基因表达载体pcDNA3．0／PNP—TK,经酶切、PCR及测序鉴定重组体,G418筛选获得稳定转染了pcDNA3．0／PNP—TK的抗性细胞克隆。RT-PCR和WesternBlotting检测PNP—TK基因在HepG2细胞中的表达。台盼兰排斥法测定细胞生长曲线,MTF法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。结果融合基因片段PNP—TK正确插入了pcDNA3．0载体中,pcDNA3．0／PNP—TK在肝癌细胞株HepG2中实现了表达。细胞抗性克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下,pcDNA3．0／PNP—TK对肝癌细胞产生了良好的旁观者效应。结论具有双自杀基因功能的表达载体pcDNA3．0／PNP-TK对肝癌细胞HepG2有着良好的杀伤作用,有望将其应用于肝癌体内治疗。     

不同启动子调控的PNP基因载体的构建和表达差异性分析

目的分别构建巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)通用启动子和甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)组织特异性启动子调控的PNP基因表达载体并分析二者表达的差异性。方法将AF0．3启动子插入载体pcDNA3．0，构建肝癌细胞特异表达载体pAF0．3；将PNP基因分别插入到pcDNA3．0和pAF0．3中，构建不同启动子调控下的PNP基因表达载体pcDNA3．0／PNP和pAF0．3／PNP；通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体。采用脂质体介导法将两种PNP基因表达载体转染不同的细胞株，RT—PCR检测PNP基因在各细胞株中的表达，分析二者表达的不同。结果各目的片段均成功插入相应的载体中，CMV启动子调控下的PNP基因在各株细胞中均实现了表达，而AF0．3启动子调控下的PNP基因则在AFP阳性肝癌细胞中实现了组织特异性表达。结论两PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效的治疗载体，且pAF0．3／PNP还实现了在AFP阳性肝癌细胞中的靶向性表达。     

PNP/MeP-dR系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的探讨新型嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤-2′-脱氧核糖核苷(PNP/MeP-dR)自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用。方法构建PNP基因真核表达载体pcDNA3.0/PNP,脂质体介导法将其导入HepG2细胞,利用G418筛选获得稳定转染PNP基因的细胞株HepG2/PNP。采用台盼蓝拒染法测绘细胞生长曲线,MTT法和FCM检测细胞对MeP-dR的敏感性及旁观者效应,HPLC检测PNP酶活性。结果HepG2/PNP细胞对MeP-dR十分敏感,作用4d后MeP-dR对HepG2/PNP的IC50为4.5μmol/L,而100μmol/L的MeP-dR即可最大限度地杀死HepG2/PNP细胞。100μmol/L MeP-dR作用8d后,混合细胞中HepG2/PNP比例仅占5%即可导致所有细胞死亡。HPLC结果显示,PNP基因产物能够将MeP-dR转化为6-MP。结论PNP/MeP-dR系统对肝癌细胞的杀瘤效果明显优于传统的自杀基因系统。本研究为该系统应用于肝癌体内治疗打下基础。     

pcDNA3.0/PNP-CD和pcDNA3.0/PNP表达载体的克隆和表达

目的 :构建新型PNP/Mep dR自杀基因系统的融合和单基因表达载体。方法 :利用DNA重组技术制备融合自杀基因PNP CD ,将其和PNP单基因分别插入真核表达载体pcDNA 3 0中 ,构建融合与单自杀基因表达载体pcDNA 3 0 /PNP CD和pcD NA 3 0 /PNP ;酶切、PCR及测序鉴定两重组体。结果 :成功构建了两个新型自杀基因载体并实现在HepG2肝癌细胞株中的表达。结论 :两个新型自杀基因表达载体 ,尤其是PNP CD融合自杀基因载体 ,是肿瘤基因治疗中广谱、高效的治疗载体。