D2-43病毒E蛋白在酵母细胞表面的展示

目的：在酵母细胞表面展示登革2型病毒43株(D2—43)的E基因，探索利用酵母表面展示系统建立DNA改组筛选平台的可行性。方法：通过RT-PCR扩增获得D2-43的E基因，将该基因亚克隆至T载体后，再克隆至酵母表面展示载体pYDI，于酿酒酵母EBY100中利用半乳糖进行诱导表达。表达产物采用间接免疫荧光法和FACS进行检测。结果：酵母表面展示产物可与D2-43的腹水抗体特异性地结合；在半乳糖诱导后24h，展示E蛋白的酵母细胞百分数达22．07％。结论：本研究为建立基于酵母表面展示系统的DNA改组筛选平台奠定了基础。     

登革热对军事行动的影响及美军的对策

登革热 (denguefever ,DF)是世界范围内最常见的虫媒病毒传染性疾病 ,估计每年有 1亿例感染[1] 。它是由黄病毒科、黄病毒属的登革病毒引起的 ,以白纹伊蚊和埃及伊蚊为其主要传播媒介。登革热最显著的临床症状是急性高热 ,伴眼眶后痛、出疹、胃肠道症状、肌痛和骨痛。有时骨痛相当强烈 ,因此登革热也称为“断骨热”。登革热的严重形式包括登革出血热 (denguehaemorrhagic ,DHF)和登革休克综合征 (dengueshocksyndrome ,DSS)DF的病死率很低 ,而DHF或DSS的病死率通常为 5 % ,如治疗不及时可高达 30 %～ 4 0 %。对登革热尚无针对性的治…     

西尼罗病毒Chin-01株基因组非编码区的序列测定及分析

目的对西尼罗病毒(WNV)Chin-01株基因组非编码区(UTR)序列进行测定,了解其与已报道毒株的序列差异及系统发育关系。方法采用5′和3′RACE法对Chin-01株病毒基因组的UTR进行RT-PCR扩增,测定扩增产物序列,采用DNAstar软件对该株及其他9株WNV的UTR进行序列同源性分析,同时构建了基于3′UTR的系统发育树,并用RNA structure软件预测其二级结构。结果Chin-01株基因组5′和3′UTR分别为96nt和630nt,序列同源性分析的结果表明,其5′UTR与其他9株的同源性均达到99%或100%,而3′区UTR与埃及Eg101株的同源性最高,达98·1%。5′UTR的起始核苷酸为AG,并含有一段与3′UTR互补的14nt序列。3′UTR的末端为CUOH,包含一段完全保守的5nt序列,以及三个保守的称为CS2、RCS2和CS1的基序。二级结构预测发现,Chin-01株5′UTR呈长茎环结构,3′UTR的3′端也可形成多个保守的茎环结构。结论Chin-01株与埃及Eg101株亲缘关系最为密切。     

登革1型病毒广州2006年分离株的基因组特征与进化分析

目的 对2006年分离自广州登革热患者血清的4株登革1型病毒(GZ57/06、GZ63/06、GZ69/06和GZ128/06)进行全基因组序列测定,并同其他毒株序列进行比对分析,以了解其基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将登革1型病毒分离株基因组分为9个片段进行RT-PCR扩增,5'与3'末端序列采用RACE法扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果 测序获得的4株广州登革1型病毒基因组全长均为10 735核苷酸(m),编码3 393个氨基酸.5'和3'端各有一段非编码区,长度分别为94nt和462nt.4株病毒的编码区与非编码区核苷酸及氨基酸序列存在一些差异,其中GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株的基因组核苷酸和氨基酸序列同源性均在99%以上,而GZ128/06株变异较其他3株大,编码区差异尤其明显.序列比对分析表明,GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株均与泰国2001年分离毒株ThD1/0049/01和ThD1/0102/01同源性最高,而GZ128/06毒株与缅甸1998年分离毒株D1.Myanrmr.31987/98同源性最高.这些新分离毒株与东南亚毒株属于同一基因型.结论 新分离毒株可能来自泰国等东南亚国家和地区,不同毒株表型差异可能与其基因组特征具有密切关系.     

黄病毒衣壳蛋白研究进展

衣壳蛋白是黄病毒的主要结构蛋白之一,除与RNA结合构成病毒核衣壳外,衣壳蛋白还参与了病毒感染的其他过程。同时,衣壳蛋白作为减毒突变的靶标为黄病毒疫苗的研究提供了新的思路。本文就黄病毒衣壳蛋白的结构、功能及其在疫苗研究中的应用做一综述。     

重要呼吸道病毒病原的多重RT-PCR检测

目的 建立一种可同时快速检测引起人呼吸道感染的重要病毒病原的检测方法。方法 通过对PCR反应条件的优化,建立同时检测甲型流感病毒（IA）、呼吸道合胞病毒（RSV）和SARS冠状病毒（SARS CoV）的多重RT-PCR方法。结果 该法可同时或分别扩增IA258bp、RSV348bp和SARS-CoV438bp的基因片段。检测的敏感性分别为10^17TCID50／ml、10TCID30／ml和10^1.5。TCID50／ml。采用相同的反应体系和条件,分别对其他7种呼吸道病毒（包括乙型流感病毒,副流感病毒2型,柯萨奇病毒B3和B5血清型及腺病毒2、3和7血清型）进行扩增,均未检测出扩增产物。结论此种多重RT-PCR法可在6h内完成,适用于三种重要呼吸道病毒的快速甄别。     

一株西尼罗病毒基因组cDNA亚克隆的构建与鉴定

目的：构建我室保存的一株西尼罗病毒引进毒株（CH-01）基因组全长cDNA的亚克隆，为进一步构建该毒株的感染性全长cDNA克隆奠定基础。方法：根据CH-01病毒株基因组序列中含有的特异性酶切位点，利用DNAstar及Olig06软件设计5对引物。以感染细胞中的病毒RNA为模板，通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的5个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-Teasy载体，通过片段间共有的酶切位点进行连接，最终获得基因组5′和3′半分子，并分别通过序列测定加以鉴定。结果与结论：已构建出西尼罗病毒CH-01株基因组的5′和3′半分子，经酶切鉴定和序列测定表明所获得的cDNA克隆为该株病毒的特异性序列。     

重要蚊媒黄病毒对IFN-α介导的信号转导通路的抑制作用

目的:比较并探讨日本脑炎病毒Beijing-1株和登革2型病毒43株对宿主细胞内IFN-α介导的信号转导通路抑制作用的机制.方法:采用含萤火虫荧光素酶(Luciferase,Luc)报告基因的重组载体pISRE-Luc,通过检测IFN刺激应答元件(IFN-stimulated response element, ISRE)活性对病毒感染细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的抑制作用进行定量分析.利用间接免疫荧光法观察在IFN-α作用下病毒感染细胞内STAT1分子的分布情况.进一步采用Western印迹分别检测在这两种病毒感染状态下宿主细胞内STAT1、JAK1和TYK2的磷酸化水平.结果:感染日本脑炎病毒和登革病毒的细胞在IFN-α作用下,ISRE活性与对照组相比均显著下降,而且日本脑炎病毒对宿主细胞内ISRE活性的抑制程度明显强于登革病毒;进一步研究发现,日本脑炎病毒可通过抑制JAK1和TYK2两种激酶的活性,降低STAT1的磷酸化水平,阻碍STAT1的核转运;而登革病毒则只抑制TYK2激酶的活化,降低STAT1的磷酸化及核转运水平.结论:日本脑炎病毒和登革病毒可通过不同的作用机制抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路.     

登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用

目的探讨登革4型病毒5′非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用。方法首先通过mfold3.2软件对登革4型病毒5′端RNA二级结构进行预测,确定了3个突变位点：SLB1,缺失位于短茎环82-87位5′UAR环化序列,并破坏其保守茎环结构;SLB2,在次环引入突变破坏其环状结构（M77G/C）;SLB3,突变仅涉及核苷酸,不破坏该次环二级结构（M77-78AG/GA）。然后在含有海肾荧光素酶（Renilla Luciferase,R·luc）报告基因的复制子（DEN-R·luc2A-RP）基础上,利用重叠PCR构建上述突变体。将突变体（包括相关的阳性和阴性对照复制子）分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞。通过间接免疫荧光（IFA）、RT-PCR、R.luc报告基因技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译水平进行检测。结果SLB1突变体的翻译水平并未受到显著影响,但其复制水平出现显著下调。SLB2突变体的翻译水平亦未受到显著影响,但其复制水平受到完全抑制;SLB3突变体的复制和翻译水平均受到了完全抑制。结论登革4型病毒5′非编码区SLB元件对基因组RNA复制和翻译具有重要的调控作用。     

新分离登革2型病毒福建株5‘和3’端序列测定及二级结构分析

目的：测定新分离登革２型病毒福建（ＦＪ－１０）株５’和３’端非编码区序列，分析二级结构与功能的关系。方法：从ＦＪ－１０株感染的乳小鼠脑中提取总ＲＮＡ，利用ＲＡＣＥ法分别扩增５’和３’端ｃＤＮＡ片段，并克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体中，然后分别测定插入片段的核苷酸序列，并用ＲＮＡ绘图软件预测５’和３’端非编码区的二级结构。结果与结论：ＦＪ－１０株５’和３’端非编码区长度分别为９６和４５４个核苷酸，并形成复杂的茎环结构，可能与病毒的复制和毒力有关。