微小RNA分子miR-21和miR-22对C2C12细胞成肌分化影响的研究

目的探讨微小RNA（microRNAs）分子miR-21和miR-22对于C2C12细胞体外成肌分化进程的影响。方法以C2C12细胞体外成肌分化为模型,Northern blot检测miR-21和miR-22两个分子在分化过程中的表达变化及组织表达谱,转染DNA／LNA杂合体反义链进行loss-of-fuction功能研究,RT-PCR分析其对分化相关分子的影响。结果成功建立C2C12细胞体外成肌分化模型,2个分子在分化过程中均表达上调,且它们具有各自的组织分布特点;建立了以DNA／LNA杂合体反义链为手段的microRNAs研究的loss-of-fuction平台;与对照组比较,抑制这2个microRNAs对于成肌分化相关的骨骼肌α-肌动蛋白、成肌素和MEF-2D等分子的表达没有影响。结论抑制miR-21和miR-22在C2C12细胞成肌分化过程中的上调不影响其分化,说明这2个分子对于分化的进程影响不大。     

烧伤后小鼠血清皮质酮及肝组织糖皮质激素受体水平的变化

目的：探讨烧伤小鼠24h内肝组织糖皮质激素受体时相变化特点,方法：将60只BALB／c小鼠随机分为正常对照组和实验组，实验组造成背部Ⅲ度15％－20％烧伤，分别于伤后2，4，6，12，24h测定血清皮质酮浓度，采用Western blotting ,RT-CPR在蛋白和mRNA水平测定肝组织糖皮质激素受体。结果：烧伤小鼠血清皮质酮浓度4h达到高峰，24h仍未恢复正常；肝组织糖皮质激素受体在蛋白质水平明显降低4－6h降至最低，而mRNA水平仅仅在伤后2h有短暂降低，结论：烧伤应激引起小鼠血清皮质酮水平明显升高，其受体在蛋白及mRNA水平均可降低，但蛋白降低不主要发生在mRNA水平。     

人α防御素-5多肽体外抗单纯疱疹Ⅱ型病毒作用的研究

目的 探讨人α防御素-5(human α-defensin-5, HD-5)多肽体外抗单纯疱疹Ⅱ型病毒(herpes simplex virus type 2, HSV-2)的作用及其机制.方法 以绿猴肾细胞(Vero)为宿主细胞,采用CCK-8法首先分析10～200 μg/ml浓度范围内HD-5多肽的细胞毒性,再以HSV-2感染Vero细胞,分别于感染前后和感染的同时加入100 μg/ml 的HD-5多肽,72 h后测定细胞保护率,结合细胞病变效应观察,分析HD-5抗HSV-2的作用效果和起效环节,并通过改变培养基中血清的浓度,观察血清对HD-5抗病毒作用的影响.结果 在100 μg/ml 浓度以内,HD-5多肽几乎无细胞毒性,提前或同时加入HD-5多肽可以显著抑制HSV-2病毒引起的细胞病变反应、提高细胞保护率(P<0.01),而在HSV-2感染2 h后加入HD-5多肽对Vero细胞的保护作用不明显(P>0.05);血清浓度会显著影响HD-5多肽的抗HSV-2活性,血清浓度越高,HD-5多肽对细胞的保护率越低.结论 HD-5多肽在体外具有显著的抗HSV-2感染活性,其作用机制主要是通过干扰病毒对细胞的粘附、侵入而发挥作用.     

C-Mpl基因对骨骼代谢的影响及其机制

目的 观察C-Mpl对骨骼代谢平衡的影响,并对其机制进行初步研究.方法 以6月龄野生型(WT)小鼠和C-Mpl敲除小鼠(C-Mpl-/-)作为研究对象.采用Micro-CT扫描,进行股骨远端骨小梁参数分析,包括骨密度(BMD)、骨体积与组织体积比(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)和结构模型指数(SMI).通过三点弯曲试验记录股骨生物力学强度,Von Kossa及茜素红矿化染色观察骨矿化水平,微板法检测血清钙、磷水平变化.TRAP染色观察破骨细胞数量,体外流式细胞仪检测破骨细胞凋亡.流式细胞仪检测破骨细胞的ROS含量,qPCR和Western blot分析p38、p-p38、FoxO1和Nrf2表达变化.结果 Micro-CT扫描结果提示,与WT小鼠比较,C-Mpl-/-小鼠股骨干骺端松质骨明显增多,BMD、BV/TV、Tb.N显著升高,而Tb.Sp和SMI明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05);Tb.Th两组差异无统计学意义.生物力学分析结果显示,C-Mpl-/-小鼠断裂负荷和刚度明显低于WT小鼠(P＜0.05).C-Mpl-/-小鼠股骨Von Kossa染色和成骨细胞茜素红染色均弱于WT小鼠,且血清中钙、磷含量亦明显低于WT小鼠(P＜0.05).TRAP染色结果显示,与WT小鼠相比较,C-Mpl-/-小鼠破骨细胞数量显著减少(8.667±1.202 vs 18.000±1.732,P ＜0.05).流式细胞仪检测发现,C-Mpl-/-小鼠破骨细胞凋亡率较WT小鼠明显增加[(14.54±1.17)％ vs (5.38 ±0.56)％,P＜0.05],且C-Mpl-/-小鼠破骨细胞的ROS水平明显低于WT小鼠破骨细胞(6 833.0±176.4 vs 12 933.0±202.8,P＜0.05).qPCR结果显示C-Mpl-/-小鼠破骨细胞中FoxO1和Nrf2表达水平较WT小鼠破骨细胞明显降低(P＜0.05),Westem blot结果也证实C-Mpl-/-小鼠破骨细胞中p-p38、FoxO1和Nrf2表达均显著下降(P＜0.05).结论 C-Mpl基因对骨骼代谢存在一定影响,C-Mpl敲除显著加速小鼠体内破骨细胞的凋亡,抑制破骨细胞生成,最终可能导致C-Mpl-/-小鼠的骨骼衰老速度和骨质疏松程度均明显减慢.     

小鼠微小RNA miR-22真核表达载体的构建及功能初步研究

目的 从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段并克隆到pIRES2-EGFP,构建miR-22的真核表达载体.方法 利用PCR技术从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段,克隆到质粒pUCm-T,测序正确后构建到真核表达载体pIRES2-EGFP中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行序列测定.脂质体Lipofectamin 2000法转染Hela细胞后G418筛选获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过RT-PCR方法对neo片段进行鉴定,采用Northern blot技术检测miR-22的表达.结果 PCR扩增得到的334 bp片段与预期的miR-22前体对应的基因组片段序列一致;成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/miR-22,测序结果正确.重组质粒转染Hela细胞后,经G418筛选成功获得阳性克隆.Northern blot分析显示miR-22在Hela细胞内高效表达.结论 本实验成功克隆了miR-22的前体对应的基因组片段,构建其真核表达载体,并在Hela细胞内获得高表达,为深入研究微小RNA miR-22的功能奠定了基础.     

烧伤小鼠IFIT1表达的初步观察

目的 观察烧伤小鼠干扰素诱导表达蛋白IFIT1的表达变化,初步探究其表达变化的原因.方法 实验小鼠致TBSA 15%Ⅱ度烧伤,1 d及7 d后处死,取肝、肺及脾组织.脂多糖掺入小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7的培养基中,至终浓度0.1～1.0μg/ml,作用6 h.提取组织及细胞RNA,进行半定量逆转录-聚合酶链式反应,提取组织及细胞裂解上清,进行免疫印迹检测.结果 小鼠肝、肺、脾组织IFIT1的转录在烧伤后1 d升高,伤后7 d恢复至伤前水平;肝、肺、脾IFIT1的蛋白水平在伤后1 d一致升高,伤后7 d仍能检出升高.体外实验,细菌脂多糖显著激活RAW264.7细胞的IF-IT1转录及蛋白表达.结论 烧伤小鼠伤后早期IFIT1表达迅速升高,此变化与同期的内毒素血症引起的细胞应激有关.     

IL-1对肾小球系膜细胞增殖和周期素依赖激酶2表达的影响

目的 探讨白细胞介素－１（ＩＬ－１）对肾小球系膜细胞增殖及周期素依赖激酶２（ＣＤＫ２）表达的影响。方法 利用体外培养的大鼠肾小球系膜细胞,分别采用噻唑蓝掺入法、流式细胞仪检测、免疫细胞化学等观察ＩＬ－１作用前后系膜细胞增殖民政部以及ＣＤ听表达变化。结果 ＩＬ－１可以明显促进系膜细胞增殖,同时伴有ＣＤ听表达增高。结论ＩＬ－１对系膜细胞有明显的促增殖春机制可能与影响ＣＤＫ２的表达有关。     

核化生武器损伤防治学的一体化教学及思考

核化生武器损伤防治学是军事医学的重要课程之一,当既往作为独立课程的核、化、生武器损伤防治学从三门不同课程合并为一门课程教学时,既要掌握其中的共性,也要强调它们各自的特点与差异,这对教学双方特别是教员提出了更高的要求。在理论教学基础上,注重核化生应急处置实训、军事医学综合演练等教学实践,进一步强化教员相关知识、装备与技能的交叉学习、培训;学员职业情操与道德素养提升以及自主学习、解决问题能力的培养;建立长期的学员-教员,工作单位-学校交流渠道等是巩固提高教学质量的重要举措。     

腹盆腔放疗诱发肠道微生态失调与肠源性感染的实验研究

目的 探索腹盆腔放疗照射对肠道微生态的影响及其与肠源性感染的关系。方法 模拟腹盆腔放疗照射BALB/c小鼠,2.0 Gy/d,连续照射5 d/周,分别于照射3周、5周和6周后停照1周的时间点收集回肠组织及其内容物样本。用实时定量RT-PCR检测抗菌肽和促炎性因子的表达;用PCR检测细菌在小鼠体内的移位情况;用变性梯度凝胶电泳技术检测分析肠道微生态的特征。结果 腹盆腔照射诱发了肠道潘氏细胞隐窝素-1和-4表达紊乱,照射3周或照射6周后停照1周,小鼠回肠隐窝素-1和-4均呈现显著性降低(t=-7.43、-3.54、-4.72、-4.27,P<0.05);而照射5周小鼠回肠隐窝素-1和-4表达明显升高(t=6.15、5.75,P<0.05)。放疗模拟照射3和5周时小鼠肠道微生物区系多样性指数和丰富度显著降低(t=-3.49、-4.19、-3.44、-4.97,P<0.05),呈现以乳酸杆菌等益生菌减少,大肠杆菌和弗氏志贺氏菌等条件致病菌增多为特征的微生态失调。受照小鼠肠系膜淋巴结和血液中的细菌DNA阳性率明显增高。照射3和5周后回肠组织IL-1β、IL-6和TNF-α显著性高表达(t=4.85、6.16、7.71、4.60、4.86、5.97,P<0.05);照射6周后停照1周时,肠道促炎性因子的表达量有所回落,但IL-1β和TNF-α的表达量仍显著性高表达(t=3.67、5.88,P<0.05)。结论 腹盆腔放疗可诱发肠道抗菌肽表达紊乱,引起肠道微生态失调,进而导致肠源性细菌移位及感染性炎症的发生。微生态可能成为减轻放疗患者消化道不良反应的有效干预靶点。