携带肝细胞生长因子基因重组质粒在大鼠体内的组织分布研究

目的 研究携带肝细胞生长因子基因的重组质粒（pUDKH）经肌肉注射给药后在大鼠体内的组织分布及其与大鼠基因组DNA的整合情况。 方法 二级Wistar大鼠雌雄各20只，按体重和取样时间的不同随机分为12h、24h、3d、7d、14d、21d的各实验组（给予pUDKH，2．0mg／kg）和注射后3d取样的对照组（给予PBS，200ul／只），依次将各组大鼠摘眼球取血后脱臼处死，按脑、心、肺、胸腺、肝、肠系膜淋巴结（MLN）、脾、肾、生殖腺、左腿肌肉、右腿肌肉的顺序取样。经典酚／氯仿抽提法提取各组织总DNA，应用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，PCR方法检测其中的D肌动蛋白基因；巢式PCR检测各组织总DNA中pUDKH的分布情况；ApnL I酶切分离pUDKH分布阳性各组织中的pUDKHDNA和基因组DNA，巢式PCR检测pUDKHDNA与基因组DNA的整合情况。 结果 各组织总DNA浓度与纯度均符合实验需要，并适于采用PCR或巢式PCR方法进行体内组织分布及基因组DNA整合情况检测。巢式PCR检测显示，在各时间点的右腿肌肉与外周血、注射后3和7d的肝脏、3和14d的生殖腺、7d的胸腺、7和14d的MLN与左腿肌肉等组织中pUDKH分布均呈阳性，而在各时间点的脑、心、肺、脾、肾等组织中pUDKH分布均呈阴性。pUDKH分布阳性的各组织中均未检测到pUDKHDNA与基因组DNA的整合。 结论 pUDKH经肌肉注射给药后，在各时间点大鼠体内各组织中呈现不同的分布谱。在pUDKH分布阳性的各组织中，pUDKHDNA与基因组DNA发生随机整合的概率较低。     

肝细胞生长因子基因转移预防术后肠黏连的实验研究

 目的 观察质粒DNA在大鼠术后肠黏连模型中的表达效率及肝细胞生长因子（HGF）基因转移对术后肠黏连的预防作用。 方法 以 pcDNA3-HGF 转染 CHO 细胞 24 h后收集培养上清，用 ELISA 测定培养上清中 HGF 的浓度；取培养的大鼠腹膜间皮细胞作划痕试验，观察表达 HGF 的培养上清对间皮细胞迁移的影响。利用无菌干纱布擦伤盲肠的方法建立 Wistar 大鼠术后肠黏连模型，将模型大鼠随机分为 5 组，每组 10 只。其中 4 组分别于创面涂布 pcDNA3-HGF 10、50、100 和 200 g，1 组于创面涂布绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒 pcDNA3-GFP 200 g 作为对照。术后第2、14 天分别解剖 pcDNA3-GFP 200 g 组大鼠各 2 只取腹膜组织，荧光显微镜下观察 GFP 的表达；术后第14天解剖各组动物，观察肠黏连的发生情况。 结果 pcDNA3-HGF 质粒转染CHO细胞后 24 h 培养上清的 HGF 浓度达 40 ng/ml，该上清能够促进大鼠腹膜间皮细胞的迁移。pcDNA3-GFP 200 g 组大鼠术后第 2 天腹膜组织中观察到 GFP 的表达，并持续到术后第 14 天。术后第14 天各组大鼠中均有发生不同程度肠黏连者，pcDNA3-HGF 10、50、100 和 200 g 组和 pcDNA3-GFP 200 g 组大鼠肠黏连发生率分别为 9/10、7/10、6/10、4/10和 9/10，其中重度（3 ~ 4度）肠黏连发生率分别为5/10、5/10、2/10、3/10、7/10，pcDNA3-HGF对术后肠黏连的预防效果呈一定的量效关系。 结论 质粒DNA能有效转染损伤腹膜并介导外源基因表达；质粒载体介导 HGF 基因转移是预防术后肠黏连的有效手段。     

体外筛选抑制K562细胞生长的放线菌代谢物

目的：建立一种适合较大量微生物代谢物抑制K562细胞生长的体外筛选方法，筛选对K562细胞具有抑制作用，而对正常细胞Vero无明显抑制作用的土壤放线菌提取物。方法：放线菌培养液加入乙醇后，置于96孔板中。经过减压除去溶剂后，用MTT法检测各样品对K562及Vero细胞的抑制作用。结果与结论：从446种土壤放线菌提取物中筛选获得5种提取物对K562细胞具有明显的抑制作用，而对Vero细胞生长抑制作用较弱。     

外周血造血干细胞的某些特性研究

本文就外周血造血干细胞的某些性能作了观察,结果表明:外周血CFU-S的辐射敏感性较低,较能耐受辐射损伤,但GM-CFUc的辐射敏感性与骨髓GM-CFUc相比则相对较高;外周血CFU—S的自杀率数据提示它处于较活跃的增殖状态;外周血CFU—S群体中7～9天亚群和11天后亚群的相对数量与骨髓比较无显著差异,但两个亚群的自我更新能力均较骨髓的为弱。     

同种Beagle狗循环血造血干细胞移植治疗急性放射病的实验研究

实验中用Ｂｅａｇｌｅ狗１０只，以０．０２４７～０．０２７８Ｃ·ｋｇ－１·ｍｉｎ－１照射量率，全身照射６．５Ｇｙ，分３组：第１组３只，作为对照，不给任何治疗，照射后全部死亡，平均活存７．５天。第２组４只，移植性别相反的同种血造血干细胞。供受体混合淋巴细胞培养刺激指数小于０．６９，红细胞交叉凝集试验阴性，未在体外去除供体血细胞中的Ｔ淋巴细胞。结果表明，照射后１１，２０和２６天检查性染色体，均为供体核型。４只狗死于严重ＧＶＨＤ，平均活存４ｌ．６天。第３组３只，移植去除Ｔ淋巴细胞的同种血干细胞，２只死亡，１只发生轻度ＧＶＨＤ，长期活存４年以上。     

蛇床子中3种逆转肿瘤细胞多药耐药活性香豆素

目的：从蛇床子Cnidium monnier中分离逆转肿瘤细胞多药耐药活性成分。方法：用生物活性跟踪法，经硅胶柱层析、RP-HPLC等。结果：分离得到3种活性成分，分别为欧芹属素乙（imperatorin），爱得尔庭（edultin），9-异丁酰氧基-O-乙酰基哥伦比亚苷元（3′-isboutyryloxy -O-acetyl columbionetin）。结论：体外实验表明3种化合物对耐药的肿瘤细胞KBV200具有明显的逆转作用。     

肝细胞生长因子基因治疗促进海水浸泡伤创伤愈合的实验研究

目的观察肝细胞生长因子(HGF)基因治疗对海水浸泡伤创伤愈合的影响。方法将20只20周龄健康雄性Wistar大鼠随机均分为单纯创伤组、创伤合并海水浸泡(创伤+海浸)组和3个给药组(0μg、20μg、40μg)。建立双侧切割伤合并海浸大鼠模型,采用INJEX无针注射器紧贴创口边缘皮肤,每创口4点注射HGF重组质粒(pUDKH)。每天观察伤口愈合情况,并测量和计算创面面积,分别于第1、6、12和16天伤口取材,HE染色后进行病理学观察。结果从致伤后第2天开始各时间点,20μg和40μg pUDKH给药组大鼠创口面积均明显小于创伤+海浸组和0μg给药组。组织病理学观察结果显示,与创伤+海浸组和0μg给药组相比,20μg和40μgpUDKH给药组于致伤后第1天的创伤部位炎性反应较轻,于致伤后第6天的肉芽组织和新生血管生长增加,再上皮化进程较早,创面愈合提前2～3 d。结论 HGF基因治疗能够促进海水浸泡伤创伤愈合,其作用可能与HGF抑制伤口局部炎症反应,促进新生血管生长和再上皮化过程等有关。     

重组腺病毒和质粒对心肌缺血治疗效果的比较

目的：研究不同载体对基因治疗效果的影响。方法：采用本实验室建立的犬心肌缺血动物模型，通过冠状动脉造影和TTC染色两种方法比较了携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒Ad-HGF和质粒puDKH对心肌缺血的治疗效果；并且在体外采用绿色荧光蛋白报告基因测定了不同载体对原代心肌细胞的转染率。结果：重组腺病毒Ad-HGF对心肌细胞的转染率和心肌缺血的治疗效果均发于重组质粒puDKH.结论：导入系统是影响基因治疗效果的关键因素之一。     

腺病毒介导的p53、GM-CSF和B7-1基因对Lewis肺癌的治疗作用

目的:体内观察腺病毒介导的p53、GM-CSF和B7-1基因的抗肿瘤及协同化疗或放疗的作用.方法:建立C57小鼠的Lewis肺癌模型,瘤内注射不同剂量的上述三个基因重组的腺病毒,确定重组腺病毒治疗小鼠Lewis肺癌的有效剂量;与此同时观察有效剂量的重组腺病毒和放疗或化疗协同作用.结果:腺病毒介导的p53、GM-CSF和B7-1基因治疗小鼠Lewis肺癌的有效剂量为5×108pfu,该重组腺病毒与放疗或化疗联合应用可以显著提高小鼠Lewis肺癌对放疗或化疗的敏感性.结论:腺病毒介导的p53、GM-CSF和B7-1基因对小鼠Lewis肺癌具有良好的治疗作用;该重组腺病毒联合放疗或化疗可以显著提高小鼠Lewis肺癌对放疗或化疗的敏感性.     

肝细胞生长因子对正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞的影响

目的:采用携带肝细胞生长因子(HGF)腺病毒转染正常皮肤成纤维细胞(NFB)和增生性瘢痕成纤维细胞(HFB)后,观察HGF对这两种细胞作用的差异,为HGF基因治疗病理性瘢痕提供理论基础。方法:分离培养HFB和NFB,以不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒(Ad-GFP)转染细胞,用流式细胞仪检测转染效率;以MOI为100携带HGF基因的腺病毒(Ad-HGF)转染HFB和NFB48h后,酶联免疫吸附法检测细胞上清中HGF、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达;应用免疫组织化学方法检测正常皮肤和增生性瘢痕组织中MMP-1和TGF-β1的分布。结果:NFB和HFB在腺病毒转染效率和HGF表达方面差异无显著性,但HGF能明显促进HFB分泌MMP-1,抑制HFB表达TGF-β1。结论:促进HFB分泌MMP-1和抑制HFB表达TGF-β1可能是HGF治疗病理性瘢痕的细胞和分子生物学基础。