变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A的表达、纯化与鉴定

目的在大肠杆菌中高效表达变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A(ribose 5-phosphate isomerase A,rpiA),并对表达产物进行纯化和鉴定。方法根据GenBank中变异链球菌UA159株基因组rpiA的DNA编码序列,设计PCR引物,扩增变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A的DNA编码序列,将其克隆至pGEX-6p-1载体中,构建重组质粒,将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达;对培养温度、IPTG用量、诱导时间等条件进行了优化;用亲和层析、离子交换层析纯化目标蛋白;用SDS-PAGE和质谱对目标蛋白进行鉴定。结果变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A在大肠杆菌中高效、可溶性表达,经质谱鉴定及SDS-PAGE分析,表达产物为变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A蛋白。经过纯化,得到纯度高达95%的变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A。结论成功地在大肠杆菌中高效表达了变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A蛋白,并建立了纯化工艺,得到高纯度的重组蛋白,为进一步研究变异链球菌属核糖-5-磷酸异构酶蛋白的生物学活性及功能奠定了基础。     

体外循环期间肺动脉持续氧合血灌注对肺功能及细胞间黏附分子-1表达的影响

目的:探讨体外循环(CPB)期间肺动脉持续氧合血灌注对肺功能及肺组织内细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法:实验用健康小型猪随机分为两组,对照组常规行CPB,实验组行CPB期间肺动脉持续灌注氧合血。分别于不同时间点留取肺组织和血液标本,进行肺功能和肺含水率的测定以及肺组织的病理学观察,并采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肺组织ICAM-1mRNA的表达。结果:与对照组相比,实验组肺静态顺应性(Cstat)、肺氧合指数(OI)、呼吸指数(RI)等肺功能指标均有显著改善(P<0.05～0.01),肺含水率明显下降(P<0.05),肺组织损伤程度明显减轻;实验组ICAM-1mRNA的表达量也较对照组显著降低(P<0.01)。结论:CPB期间经肺动脉持续灌注氧合血可减轻肺损伤、保护肺功能,而ICAM-1可能参与了这种保护机制。     

低氧诱导VEGF基因表达载体治疗家兔肢体缺血性疾病的实验研究

目的探讨低氧诱导血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达载体对家兔肢体缺血性模型的基因治疗效果。方法通过切除髂外动脉远端和股动脉分支制作家兔左后肢缺血模型,术后立即将含VEGF基因的低氧诱导表达载体6HRE-pcDNA-VEGF165多点注射至患侧肌肉内,并于不同时间点进行后肢胫动脉血压测量和动脉血管造影。结果与对照组相比,应用低氧诱导VEGF基因表达载体的基因治疗组胫动脉血压恢复快;动脉血管造影显示基因治疗组动脉充盈早于对照组,新生血管多于对照组,早于对照组建立侧支循环。结论低氧诱导VEGF基因表达载体可促进家兔肢体缺血模型新生血管的形成,改善缺血肢体的血液循环。     

低氧诱导人VEGF基因表达载体的构建及其蛋白表达检测

目的以人血管内皮细胞生长因子（hVEGF）基因的低氧反应元件（HRE）作为增强子,构建含HRE的真核表达载体,探讨含HRE不同拷贝数的载体对低氧的反应状态。方法将人工合成的HRE串联后与CMV启动子连接,替换pcDNA3.1的启动子部分,构建成低氧诱导真核表达载体;将hVEGF基因重组到此载体中,转染BHK细胞。用免疫组化染色法检测VEGF的表达,用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测低氧前后细胞hVEGF表达的变化。结果成功构建了含HRE的低氧诱导真核表达载体4HRE-pcDNA-VEGF和6HRE-pcDNA-VEGF。转染细胞后进行低氧培养,VEGF的表达均增高,含6HRE的低氧诱导作用高于4HRE。结论在含HRE的真核表达载体中,低氧时可诱导基因的表达,其拷贝数可影响诱导作用的强度。     

四妙勇安汤对糖尿病大鼠肢体缺血治疗作用及其分子机制

目的研究四妙勇安汤对糖尿病后肢缺血大鼠的治疗作用及对丝苏氨酸蛋白激酶（Akt）、p38丝裂原活化蛋白激酶（P38）蛋白水平的影响。方法40只Wistar大鼠完全随机分为4组：对照组、对照治疗组建立单纯缺血模型;模型组、模型治疗组建立糖尿病肢体缺血模型,对照治疗组、模型治疗组给予四妙勇安汤治疗。分别于术前、术后即刻、术后第3、7、14天测下肢血流变化,术后15d取腓肠肌组织免疫组织化学CD31染色血管内皮细胞观察新生血管密度,及蛋白印迹法检测内皮细胞Akt、P38蛋白变化情况。结果模型组血管损伤严重,血管重建能力明显降低,第7天对照组、对照治疗组、模型组、模型治疗组血流比值为（45±4）、（49±3）、（364-3）、（48±6）％,第14天血流比值为（63±6）、（66±4）、（45±4）、（61±4）％,与模型组比较,其余3组差异均有统计学意义（P〈0．05）。模型组术后15d新生血管密度明显减低,Akt蛋白表达明显降低,P38表达明显升高,其他3组与其差异均有统计学意义（P〈0．05）;四妙勇安汤能够明显增加新生血管数量[模型组、模型治疗组分别为（9．1±2．0）、（16．4±2．9）个,P〈0．05,模型组、模型治疗组比值分别为（0．62±0．15）、（0．86±0．18）％,P〈0．05],增加Akt蛋白表达,降低P38表达,差异均有统计学意义[模型组与模型治疗组蛋白相对光密度比值：Akt：（0．20±0．07）、（0．28±0．56）％;P38：（1．18±0．23）、（0．99±0．04）％,P〈0．05],对照治疗组未发现中药治疗后副作用。结论四妙勇安汤能够改善糖尿病下肢缺血血运重建过程,加快血管新生速度,其作用机制可能是通过促进Akt表达,抑制P38表达实现的。     

微波辅助的蛋白质酶解方法

<正>近些年,蛋白质组学研究技术手段不断进步,研究策略不断更新,归纳起来主要分为2种策略:"top-down"策略和"bottom-up"策略。"top-down"策略是先对蛋白质混合物进行分离,然后进行蛋白质酶解和质[1-2]     

人血管内皮生长因子基因的克隆、表达及生物活性分析

目的 克隆人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因,构建真核表达载体,观察其对脐静脉内皮细胞的增殖作用和血管新生的影响。方法 利用RT-PCR方法,从人扁桃体组织中扩增人VEGF165 cDNA完整编码区,并构建成pcDNA3．1( )／VEGF165(简称pcDNA／V)重组体;应用脂质体介导的基因转移技术将构建的真核表达载体pcDNA／V体外转染至人脐静脉内皮细胞(HUVEC),MTT法检测其对内皮细胞增殖的影响。建立家兔下肢缺血模型,注射重组质粒pcDNA／V,pcDNA3．1( )空质粒作对照,选取不同时间点,行血管造影。结果 构建的真核表达载体pcDNA／V的酶切电泳分析和测序表明结果正确。pcDNA／V转染HUVEC能明显促进内皮细胞的分裂增殖。血管造影显示,术后基因治疗组远端动脉充盈早于对照组,新生血管数目也明显多于同时期对照组。结论 成功克隆了人VEGF165基因,构建了其真核表达载体。体内外生物学活性研究证实,重组质粒的表达产物具有刺激HUVEC增殖和促进缺血肢体侧枝循环建立的功能。     

VEGF及bFGF基因治疗家兔肢体缺血的实验研究

我国中老年人肢体缺血性疾病的发病率为5～10/10000[1],在美国每年接受外周血管手术的患者达10万左右[2].很多患者由于肢体远端流出道血管条件不佳,外科搭桥手术或血管腔内介入治疗失败,药物治疗的效果有限,而不得不截肢.     

Hela细胞蛋白质分离和肽质量指纹谱鉴定方法的建立

目的研究Hela细胞总蛋白质的分离及利用肽质量指纹谱对蛋白质进行鉴定的方法。方法提取了Hela细胞的总蛋白质,通过双向电泳技术对蛋白质进行了分离,并应用图像扫描仪及图像分析软件获取蛋白质点的数字化信息。对其中不同丰度的蛋白质点,进行胶内酶切后,通过基质辅助激光解吸/电离直角型飞行时间质谱(MALDIO-TOF-MS)分析,再将检测出的多肽质量数通过Mascot搜索引擎检索NCBInr数据库。结果获得了Hela细胞总蛋白质双向电泳图谱及蛋白质点的数字化信息,通过MALDIO-TOF-MS检测得到的肽质量指纹谱再经过网上公共数据的检索从而获得3个蛋白质点分别是α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、γ-肌动蛋白(γ-actin)和过氧化物酶2(peroxiredoxin 2)。结论Hela细胞总蛋白质双向电泳的分离效果较好,肽质量指纹谱法能有效地对Hela细胞的蛋白质斑点进行鉴定。