Establishment of in vitro cellular model predicting histocompatibity in allograft

Histocompatibility is crucial in effecting survivalof allografts.Due to differences in histocompatibilitybetween donor and recipient,rejection would happento some extent after transplantation. Therefore,theevaluation of differences in histocompatibility betweendonor and recipient would be contributive to selectionof donor and judgement on prognosis oftransplantation. HLA typing and mixed lymphocyticreaction (MLR) are the classical methods to evaluatethe histocompatibility between donor and r…     

输注人PBMC建立“人-鼠”异种移植物抗宿主病模型1

目的:摸索X-GVHD模型的合适小鼠品系,建立稳定的“人-鼠”X-GVHD模型。方法:选取了裸鼠、NOD/SCID经亚致死剂量γ射线全身照射后,腹腔输注健康人外周血单核细胞(PBMC)建立异种X-GVHD模型。通过检测人T细胞在模型鼠外周血、组织、器官中的浸润情况等指标(采用流式细胞术和免疫组化技术),比较两种模型鼠中人免疫细胞的浸润率和各组生存时间,从而确定建立X-GVHD模型的合适小鼠品系,并摸索人PBMC的输注途径和合适细胞量,以及观察免疫细胞表型变化与功能的最佳时间窗口。结果:NOD/SCID鼠更适合诱导“人-鼠”X-GVHD模型的小鼠;腹腔输注途径和尾静脉输注途径对建立“人-鼠”X-GVHD模型无明显差异;腹腔输注5×107以上人PBMC可以成功建立“人-鼠”X-GVHD模型。在采用优化后的实验条件建立模型中,监测人T细胞表型动态变化与功能的最佳时间窗口为7~11 d;模型鼠的平均生存时间为(14.16±1.77)d。结论:NOD/SCID鼠通过腹腔注射5×107以上人PBMC可以成功建立“人-鼠”X-GVHD模型,7~11 d为监测人T细胞表型动态变化与功能的最佳时间。     

纳米中药升白液抗环磷酰胺所致小鼠免疫损伤的研究

目的:探究纳米中药升白液抗环磷酰胺所致小鼠免疫损伤的作用。方法:采用环磷酰胺(CTX)制备Balb/c小鼠免疫损伤模型,检测纳米中药升白液口服给药后不同时间段对环磷酰胺所致小鼠白细胞减少的保护作用。在纳米中药升白液口服给药8 d后,乙醚麻醉处死小鼠,称量胸腺、脾脏并计算其脏器指数;通过组织病理切片观察纳米中药升白液对小鼠肝脏、脾脏病理形态的影响。结果:CTX模型组白细胞数、胸腺及脾脏指数均明显低于正常对照组(P0.01);纳米中药升白液各剂量组给药8 d后的白细胞数、胸腺及脾脏指数均明显高于CTX模型组(P0.01或P0.05)。病理学检查显示,与正常对照组比较,CTX模型组脾组织和肝细胞坏死明显,脾脏和肝脏淤血明显,脾脏多核巨细胞反应明显,脾脏淋巴细胞数量减少;与CTX模型组比较,纳米中药升白液各剂量组脾组织和肝细胞坏死明显减轻,脾脏和肝脏淤血减轻,脾脏多核巨细胞反应明显减少,脾脏淋巴细胞数量回升(P0.05)。结论:纳米中药升白液对环磷酰胺所致的小鼠免疫损伤具有明显的防护作用。     

sHLA-A*2402融合蛋白的制备与特性研究

本文用含有HLA-A*2402重链胞外段基因的质粒为模板进行PCR,利用下游引物拼接上依赖BirA的可生物化序列后,构建融合基因sHLA-A*2402-BSP,与质粒pET-21d重组后,在宿主菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达的融合蛋白与β2m及HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行复性折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并用Westernblot和夹心ELISA法鉴定。证实成功地制备出sHLA-A*2402-生物素化序列融合蛋白并使之正确折叠复性。为研究在原核系统中表达、纯化与复性及体外构建MHCI类分子四聚体,探讨免疫识别机制奠定了基础。     

表达载体sHLA-A2-IgG1-Fc的构建与鉴定

目的构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgGl-Fc,为进一步真核表达可溶性HLA-A2-IgG1-Fc蛋白奠定基础。方法从T2细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术扩增包括信号肽的可溶性HLA-A2的cDNA序列并把其插入真核表达载体pcDNA3.0,然后经酶切和测序法鉴定;用PCR的方法从含IgG1-Fc基因的PIG质粒中扩增目的基因IgG1-Fc段,然后经酶切后插入前面构建好的表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2中,最后经酶切和测序法鉴定。结果经酶切鉴定及测序分析,证实已将目的基因HLA-A2和IgG1-Fc片段插入载体pcDNA3.0。结论本研究成功构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgG1-Fc。     

鉴定T淋巴细胞亚群的SPA-Ig直接花环法

用SPA-Ig 直接花环法检测T 淋巴细胞亚群,较间接荧光法简便、特异、经济,其方法如下。     

长期混合淋巴细胞培养-细胞毒实验模型的建立

目的：建立一种能较逼真地模拟移植排斥反应的体外实验模型。方法：利用EB病毒转化的BI林巴母样细胞系作为刺激细胞,诱导同种异体或异种外周血单个核细胞增殖,并分化为效应细胞,然后检测效应细胞对刺激细胞源靶细胞的杀伤活性,建立长期混合淋巴细胞培养,细胞毒实验模型。结果：用不同刺激细胞诱导产生的效应细胞能有效杀伤刺激细胞来源的靶细胞,进一步克隆实验证实这种杀伤效应是由CD8^ 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）所致,结论：长期混合淋巴细胞培养－细胞毒实验模型能较逼真地模拟器官移植受者体内发生的由CTL介导的急性排斥反应。     

脓毒症毛细血管渗漏的研究进展

脓毒症是重症医学科常见的、复杂的、高致死性的临床综合征。脓毒症患者的主要死因是暴发性全身炎症反应引起的MODS。部分脓毒症患者可出现低蛋白血症、低血压、少尿、水肿、MODS等表现,即毛细血管渗漏综合征(CLS),而释放炎症介质导致多系统的、难以控制的毛细血管渗漏是脓毒症患者出现MODS的主要原因。CLS的主要病理生理学机制为高细胞因子血症引起的血管通透性增加。液体复苏是CLS治疗的重要组成部分。深入理解脓毒症毛细血管渗漏的病理生理学机制对临床工作有重要的意义。     

血管内皮细胞系表达的HLA-G1抑制同种T细胞增殖及活性

目的研究血管内皮细胞系人脐静脉内皮细胞(ECV304)表达的HLAG1分子对同种异体T细胞增殖的作用。方法采用脂质体介导的DNA转染技术,将构建的真核表达质粒pcDNA3HLAG1转染ECV304,用免疫荧光法检测其表达的HLAG1分子。将表达HLAG1的ECV304与同种异体T细胞进行混合细胞培养后,用四甲基偶氮唑(MTT)比色法检测ECV304表达HLAG1对外周血T细胞增殖和抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的影响。结果ECV304转染pcDNA3HLAG1后可稳定表达HLAG1分子;转染空质粒pcDNA3和转染pcDNA3HLAG1的T细胞的刺激指数分别为(1.59±0.41)和(1.33±0.46),二组比较,差异有统计学意义(P<0.05);细胞毒实验显示,抗原特异性CTL对转染空质粒pcDNA3和转染pcDNA3HLAG1的ECV304的杀伤率分别为(64.81±3.07)%和(52.33±4.48)%,二组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论HLAG1分子可以抑制同种异体T细胞的增殖和CTL的细胞毒作用。